1 背景知识介绍

1.1 互补DNA（Complementary DNA，cDNA）

cDNA是一种由mRNA逆转录而来的DNA（有单/双链两种情况），通常用于研究基因表达和克隆。cDNA是单链还是双链得根据实际情况，例如RT-PCR, 3'或5' RACE，我们只使用单链cDNA(第一链cDNA)，其它情况如构建表达载体，qRT-PCR等是双链。一般情况下，cDNA它是在体外经过逆转录后与RNA互补的DNA链（可以参见转录试剂盒的说明书），但是与基因组的DNA复杂序列不一样，因为cNDA来自于mRNA，因此cDNA只有外显子，因为mRNA是通过DNA转录而来，内含子序列或者绝大部分内含子序列已经被丢弃（这原理就是mRNA的剪切作用）。

（图1 cDNA合成示意图）

一般合成cDNA使用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)。逆转录酶PCR (RT-PCR)是扩增靶RNA的聚合酶链反应的一种变体。在PCR之前添加逆转录酶(RT)酶使扩增和检测RNA靶标成为可能。逆转录酶转录模板RNA并形成互补DNA (cDNA)。单链cDNA通过DNA聚合酶转化为双链DNA。这些DNA分子现在可以用作聚合酶链反应的模板。

（图2 逆转录PCR（RT-PCR）合成cDNA示意图）

1.2 实时聚合酶链式反应（Real time-polymerase chain reaction,RT-PCR）

核酸扩增和检测技术是当今生物学研究中最有价值的工具之一。生命科学各个领域的科学家——基础研究、生物技术、医学、法医学、诊断学等等——在广泛的应用中利用这些方法。实时PCR(RT-PCR)是一种使用荧光染料或探针（实验室通常称为引物）技术对样品中存在的核酸进行定量的技术或实现靶基因/序列的扩增。RT-PCR足以扩增目标或模板DNA (cDNA是其中一种)，也就是说，它可以在PCR仪器（热循环仪器）复制DNA。它使我们能够研究目标序列或基因，因此一直是遗传学中的一项关键技术。

（图3 RT-PCR准备材料仪器及一个循环实现基因扩增）

1.3 RT-PCR名词解释

预变性/变性(Denaturation)：DNA变性是指DNA双螺旋结构中碱基对的氢键断裂，使得双链变为单链的热处理过程。对双链DNA进行加热（94℃，0.5min-2min）可以使其发生变性（Denaturation），当温度升高到一定高度时，DNA在260nm（OD260是DNA的吸收峰）处的吸光度会突然发生明显的上升，并达到峰值，之后温度继续上升，其吸光度不会发生明显变化，若以温度对DNA溶液的260nm吸光度做图，会得到典型DNA变性S型曲线。增加一步预变性的目的使得DNA双螺旋解旋更彻底，同时激活热稳定的DNA聚合酶。

退火（Annealing）：反应温度降至54-60℃，反应时间约20-40秒，引物与模板DNA上的互补序列结合。这两条分离的链以相反的方向运行，因此有两个引物—上游（forward）/下游（reverse）或称为正向（sense）/反向（antisense）引物。DNA的变性发生在一个很窄的温度范围，通常将DNA加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为核酸的熔解温度(Tm, melting temperature)，也可以简单的理解为一半的DNA解开双链。

延伸（Elongation）/终延伸：温度升高到72-80℃。在存在DNA模板 + 引物+ 2x Taqmix（老式PCR试剂被分解为：dNTPs + 酶+

MgCl + buffer）的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，实现对靶基因片段扩增。碱基通过Taq聚合酶添加到引物的3 '端。这会使DNA在5 '到3 '方向上延伸补充。在最佳条件下，DNA聚合酶的速度约为1000bp/分钟。Taq聚合酶可以耐受很高的温度。它附着在引物上并将DNA碱基添加到单链上。结果，得到了一个双链DNA分子。增加一个终延伸能够更好的实现对目的片段的体外扩增。

保存（conservation）：一般选择4/12/16℃对扩增的片段在PCR仪器中进行短暂保存，当然一跑完PCR就取出，就没必要保存，这三个温度点有利于维持DNA双链的稳定性。

（图4 RT-PCR实现靶基因/序列扩增示意图）

（图5 RT-PCR扩增目的片段步骤简易示意图）

2 靶基因/序列扩增实践操作

2.1 引物的设计

引物设计的好坏直接关系到是否能够特意扩增到目的基因/序列，因此引物的设计非常重要。引物设计的具体规则，请参考本公众2023.09.03发表的推文《基因过表达（Overexpression）引物（primer）设计+质粒图谱详解》，仔细阅读相信能让你学习到很多知识。

2.2 加样体系

在此我们使用Taqmix进行讲解。一般情况下我们只是验证某个基因的有无或者引物的特异性，使用的总体积为10/20μL总体积即可，这样的目的是节省试剂。如果设计到需要回收目的片段，那么就需要50μL甚至更好的总体积，RT-PCT具体加样体系，请参考表1：

表1 RT-PCR加样体系

2.3 目的基因PCR仪器捕获/抓取/克隆/扩增

在使用PCR仪器（热循环仪）进行目的基因扩增时候，主要注意：1.Taq酶常见的使用说明书，有的公司提供的Taq酶94℃，有的需要98℃，或者其它温度；2.根据公司提供的设计程序进行设置PCR扩增程序；3.引物Tm值，根据实际引物的Tm值进行设置，一般在提供引物的Tm±5℃没什么问题，温度提高，有助于扩增（并非绝对），如果Tm值，抓不到目的序列，建议提前进行引物的梯度PCR，确定合适的Tm值。

（图6 实验室中RT-PCR扩增目的片段实际设置情况）

2.4 RT-PCR扩增序列电泳检测

电泳检测目的基因，主要使用琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis），在碱性条件下（TAE 作为缓冲液）是得DNA带上负电，进而检测目的片段的大小（图7）。根据DNA分子片段的大小和形状不同，在电场中泳动的速率也不相同，同时在样品中加入核酸染料(如 EB（剧毒致癌，保护好自己） 或花青素类染料)能够和 DNA 分子间形成络合物，经过紫外照射，可检测DNA处于琼脂糖凝胶的位置结合Marke可知分子量大小，从而达到分离、鉴定的目的，但是最终的目的片序列中的碱基需要进行测序才能知晓（图8）。简易跑胶的时候使用浓度稍微大一点，泳道稍微大一点，这样子跑出来的胶比较好看。

（图7 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳实践模拟图）

图8 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳紫外拍照结果，拖带原因打开率是DNA浓度太高）

3  结束。

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