文献学习110-宫颈鳞状细胞癌多组学分析鉴定具有生物学和临床意义的cellular ecosystems

宫颈癌是女性癌症死亡的第四大原因，其中宫颈鳞状细胞癌（CSCC）是最常见的类型。不幸的是，晚期、转移性或复发性CSCC的5年生存率仅为16.5%。尽管免疫检查点阻断(ICB)从根本上改变了临床肿瘤的治疗范式，但CSCC对免疫检查点阻断的反应有限，这与肿瘤免疫微环境(TIME)的复杂性相关。细胞异质性和可塑性是肿瘤进展和肿瘤免疫微环境调节的基础，但这些细胞状态的形成和可塑性等调控机制仍有待确定。随着单细胞及空间组学技术的进步，联合细胞微环境和空间位置来全面理解细胞功能已成为研究肿瘤免疫微环境的重要方式。

1. A single-cell expression atlas of CSCC

To comprehensively decode the CSCC ecosystem, 作者对14例未治疗患者的样本和3例对照样本进行了单细胞测序，得到哦163880个细胞，注释得到14种主要细胞类型。

2. Meta-programs within the CSCC malignant compartment

研究显示，恶性上皮细胞的转录异质性形成了其与肿瘤免疫微环境特异性的互作，决定了肿瘤命运。因此接下来作者探究了CSCC 鳞状上皮细胞的 cellular state diversity。20168个肿瘤鳞状细胞在患者间存在显著的异质性(c)。NMF显示，存在8个模块 (d)。
It is noteworthy that three MPs (MP6, MP7 和 MP8) representing various stages of squamous differentiation were identified, with signature genes primarily composed of epithelial markers such as the keratin, mucin and small proline-rich protein families.
MP6 (epithelial-cytokeratin) 与 HNSCC_epi2 signature 存在高度一致性，而与pan-cancer study 中的 epithelial senescence (Epi-Sen) 相似度较低。MP6主要富集到keratinization-related genes, 提示其鳞状细胞癌特异性特征。
MP8 (Epi-Sen)则与 HNSCC_epi1 state 和 pan-cancer 中的Epi-Sen相似，代表着一种与HPV相关的 common senescence-associated epithelial status。
MP7 (Epi-Imm) featured multiple immune cell-associated molecules (HLA-DRB, B2M and IDO1), indicating its immune-related epithelial status.

3. MP6 and MP7 exhibit distinct correlations with TIME

To prioritize the most relevant MPs associated with the TIME, we correlated the summarized expression (eigengene) values of each MP with percentages of TIME cells inferred from scRNA-seq data within individual patients.
有趣的是，MP6 与cancer-associated fibroblast (CAF) 强正相关，而与免疫细胞负相关 (CD4_Th-CXCL13, CD8_Tex-GZMK and CD4-MKI67)(e)。而MP7与免疫细胞正相关，与CAF负相关(附件)。These findings highlight the diametrically opposed association of MP6 and MP7 with immune cell infiltration.
接着，作者根据NMF的结果对MP进行分群(f, g)，结果同样显示肿瘤细胞具有很强的异质性。

4. MP6 and MP7 are associated with distinct TIP (tumor immune phenotype)

除了丰度以外，CD8⁺ T细胞的空间定位也对TIME stratification和免疫治疗反应性至关重要。为了评估MPs 和 TIPs 的关系，作者根据CD8⁺ T的分布情况对每个肿瘤进行了TIP分型（a）：
(1) infiltrated TIP with CD8⁺ T cells penetrating the tumor epithelium（肿瘤组织中有CD8T）
(2) excluded TIP with CD8⁺ T cells primarily embedded in the surrounding stroma（肿瘤周围基质中有CD8T）
(3) desert TIP with CD8+ T cell absence.（无）

根据这个分型，作者将所有的样本分为了infiltrated or
excluded/desert TIPs (b)。单细胞的结果显示infiltrated TIP CD8T细胞数量显著更多(c, d)。此外，基于RO/E的 density estimation 和 immune cell enrichment 结果提示存在显著的 TIP-specific differences, 尤其是T cell states (e-g)。更重要的是，the excluded/desert CSCCs 存在更高比例的 MP6 细胞，而且infiltrated CSCC 存在更高比例的 MP7 细胞 (Fig. 2h,i), 提示肿瘤 MPs 和 TIPs之间存在潜在关联。

5. Spatially resolved TIME neighboring MP6 and MP7

为了进一步探究MP6, MP7和免疫细胞浸润的空间关系，作者整合了单细胞数据和15例CSCC空转数据(a, b)。为了比较肿瘤MP6和MP7 states的空间异质性，作者计算了每个肿瘤 spots 的 MP6 和 MP7 signature genes 评分，随后使用了hierarchical clustering来区分每个spot到底是 MP6还是MP7(c)。结果显示这两个stat在空间上是互斥的。
为了探究TIME细胞组成和MP6以及MP7的关系，作者对每个spot进行了解卷积(d, e)，以判断MP6/MP7肿瘤细胞周围的免疫细胞存在情况。结果显示在15个空间切片上，MP7 spots的 immune cell neighborhood scores显著更高，尤其是CD4T, CD8T, B, 巨噬和DC (f)。此外，MP6, MP7 和 cell neighborhood scores的相关性分析 提示MP7和immune cell neighborhoods存在着显著正相关，而 MP6 则与 immune cell neighborhoods 负相关(g)。随后，作者检测了可以区分MPs和TIPs的marker基因的表达。Tumors with high 高表达 SERPINB3 和 FABP5 (MP6 dominant tumors) 的肿瘤 MUC4 的表达较低且缺乏 CD8 T 细胞浸润。相反，高 MUC4 (MP7 dominant tumors) 表达的肿瘤 SERPINB3- 和 FABP5-阳性肿瘤细胞较少，但是有显著 CD8 T 细胞浸润。

Fig 3

6. MP7 is spatially distinct from the conventional ‘immune-hot’ signature

为了进一步探究MP7和此前鉴定的 pan-cancer immune programs (Extended Data Fig. 2c) 的区别，作者在空间上查看了它们的表达模式。MP7 倾向于具有肿瘤上皮的代表性特征 (fig 3c)。而 pan-cancer immune signature 则倾向于分布在肿瘤边缘 (Extended Data Fig. 6f )。这提示 pan-cancer immune signature 主要反映了周边肿瘤细胞对来自其周围免疫细胞的近分泌和旁分泌信号的反应。
immune-hot signature常被用于预测肿瘤对免疫治疗的反应性，通过将immune-hot signature引入空间数据，作者发现 immune-hot activity 主要存在于基质区 (Extended Data Fig. 6g,h), 这与其作为肿瘤免疫微环境的代表性作用相一致。相反，MP7 signature 主要存在于 epithelial tumor regions, 提示其代表一种肿瘤细胞特异的状态。因此，MP7 在空间上与此前报道的 pan-cancer immune 和 immune-hot signatures存在差别。

7. Transforming growth factor β signaling is activated in MP6

MP6 status 的肿瘤细胞的存在其特异表达模式 (包括 FABP5, SPRR1B, SERPINB3, KRT6B 和 S100A8)，这些基因主要富集到 keratinization process，而 MP7 肿瘤细胞则高表达抗原呈递相关基因 (包括 HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1 和 CD74), 免疫反应 (包括 B2M, LCN2 和 CXCL10), 免疫抑制分子 (包括 IDO1, CD274, CD276 和 BTN3A1) 和多种粘蛋白 (包括 MUC1, MUC16 和 MUC20)，这些基因主要富集到抗原呈递和免疫反应通路 (a)。MP6和MP7的差异基因比较也显示了一致的结果 (b)。

为了进一步确定RNA水平变化是否会导致蛋白质的改变，作者使用了激光捕获显微切割(LCM)技术从而在空间上在不同程度的TILs中定义肿瘤的ROI (regions of interest)。作者一共分离了60个空间特异的 ROIs (约 100 × 100 μm²，每个ROI中约有60–80个细胞) 包括20个immune-rich的和40个免疫 immune-poor 的ROIs(c)。MP6特异性基因，比如 FABP5, SERPINB3, KRT6B 和 S100A8，在 immune-poor ROIs 中高表达，这与转录组数据相一致 (d)。此外，尽管25个MP7特异性基因只有3个在空间蛋白组中检测到，B2M 和多种 MHC 分子在 immune-rich ROIs 中升高 (d)。
单细胞数据的PROGENy通路分析结果显示TGFβ通路在MP6中显著富集(e)，而空间转录组的PROGENy通路分析也显示MP6比MP7有更高水平的TGFβ通路活化，空间蛋白组结果同样显示TGFβ 信号通路在 immune-poor ROIs 中显著增强(f)。值得注意的是， PROGENy TGFβ 信号主要位于MP6肿瘤区域的边缘(g)，这提示 TGFβ 通路可以改变癌周的免疫微环境，比如CAFs 和免疫细胞。

Fig 4

8. CAF enforced immune lockdown surrounding MP6 spots

最近的研究结果显示不同的 CAF 表型与异质性的TIPs有关。然而，CAF的空间定位及其亚型与肿瘤细胞的关系尚不明确。在这里，作者鉴定了7种不同的成纤维亚群，其中3群 (CAF-CD34, CAF-DES 和 CAF-MMP11) 在 CSCC 样本中比例显著上升 (a, b)。根据每个亚群的特征性基因表达，我们可以知道，CAF-CD34 细胞高表达IL-1活化信号，属于既往文献报道中的inflammatory CAFs。而 CAF-MMP11 则高表达 TGFβ 活化信号，属于 myCAFs。PROGENy 分析证实了CAF-MMP11中存在TGFβ 信号通路的激活 (c)。CAF-MMP11 表达 TGFβ-induced reactive stroma相关基因，包括 MMP11, POSTN, CTHRC1, COL8A1, COL10A1 (d)。通路分析结果同样显示其主要参与上皮基质转化和胞外基质形成 (e)。此外，CAF-MMP11显著高表达LRRC15，这个基因与抗肿瘤反应的抑制效应直接相关 (f)。
TIME中MP6评分和免疫抑制性CAF比例的正相关 (Supplementary Table 4) 及Fig 4g中MP6周围活化的TGFβ信号使得作者进一步探究了其原位空间互作和空间蛋白表达情况。因此作者计算了每个成纤维空间 spot 上 MMP11基因模块 (包括 CTHRC1, POSTN, INHBA, SFRP2, SULF1, COL8A1, COL11A1 和 LRRC15) 的表达。结果显示MP6 肿瘤细胞周围的成纤维存在上调的免疫抑制CAF特征 (Fig. 5g, left)。同时，Cyto- SPACE 显示MP6 肿瘤细胞周围的成纤维，尤其是在肿瘤-基质边缘区，主要是 CAF-MMP11，而这种现象在MP7周围的成纤维细胞中没有发现 (Fig. 5g, right)。通过评估MP6和MP7特征在成纤维周围的表达，作者观测到MP6而不是MP7和免疫抑制性CAF评分存在显著的正相关 (h)。此外，细胞互作结果也显示 MP6 周围存在上调的TGFβ信号 (Supplementary Figs. 4 and 5, Supplementary Note 5 and Supplementary Table 8)。

Fig 5

9. MP6/7 score is of clinical relevance

为了进一步探究 tumor state 和免疫表型的特异性关联，作者以单细胞数据作为参照，使用 BayesPrism25 对一项宫颈鳞癌的新辅助免疫化疗（NACT）临床试验（NCT04516616）中21例患者的RNA-seq数据进行了解卷积，以探究每个样本的MP6或MP7特征。与预期一致， 高 MP6/7 评分的肿瘤存在较低的免疫激活和免疫逃避，免疫细胞降低，immune excluded 相关细胞比如 mesenchymal stem cells, myocytes 和 keratinocytes则更高 (a)。对RNAseq队列中的20例样本的免疫组化结果显示CD8 T 细胞浸润与 MP6/7 score 负相关 (b, c)。

接着，作者对21个患者的paired pre and post one-cycle neoadjuvant chemotherapy 样本进行了RNAseq测序。显著的是，MP6/7 scores 在 one cycle of platinum-based NACT 后显著下降，而且在 pathological complete remission (pCR) 组中下降最显著 (Fig. 6d and Supplementary Table 11)。
随后作者在squamous nonsmall cell lung cancer (NSCLC) 中探究了是否 MP6 和 MP7 肿瘤状态可以提示其对 ICB therapy 的反应性。（为什么用肺癌？没有宫颈癌的队列数据吗？）在两个大型squamous NSCLC 亚型的ICB治疗队列中 (OAK 和 POPLAR; anti-PD-L1 antibody 或化疗 (docetaxel))，低 MP6/7 scores 都与免疫治疗组更好的预后相关，而在化疗组则没有这种相关性 (Fig. 6e,f)。而在 nonsquamous NSCLC中，低 MP6/7 scores 与免疫治疗和化疗组都没有显著相关性 (Extended Data Fig. 8d,e)，提示 MP6/7 scores 对 CSCC 和 NSCLC 免疫治疗反应性的潜在预测作用。

Fig 6

10. FABP5 mediates MP6 state maintenance

MP6 和 MP7肿瘤 states 与CSCC 的表观改变而不是基因异质性更相关 (Supplementary Fig. 7 and Supplementary Note 7)。作者随后探究了 MP6 state的 defining features。除了角化基因的表达，其特征性基因还包括 SERPINB3 和 S100A8/A9，两者都与 CSCC的 advanced stage 和 unfavorable prognosis 相关。有趣的事，top-scoring 差异性表达基因中有一个分子是 FABP5/FABP5 (Fig 4 a, b)。这个分子编码脂肪酸结合蛋白，在此前被报道与多种癌症相关。沉默 FABP5 在宫颈癌和HNSCC细胞系中引起显著的 MP6 特征基因表达的下降(a, b)。FABP5-IN-1, 一种选择性 FABP5 抑制剂，抑制了CSCC患者来源的类器官形成，同时S100A8/A9 和 SERPINB3 的表达也下降 (c, d)。这些结果提示 FABP5 可能不仅是 MP6 细胞的标志基因，可能同样参与MP6 state的获得和维持。
此外，在多种细胞系中敲除或药物抑制FABP5 均显著降低了 TGFβ 的表达，尤其是 TGFβ2 isoform。其下游信号通路分子表达也下降 (Fig. 7e–h and Extended Data Fig. 10h,i)。因此，MP6 tumors中 TGFβ 的产生和下游信号至少部分通过FABP5介导。接着，作者使用有或没有 FABP5 knockout (ko-FABP5)的TC-1肿瘤细胞的条件培养基对小鼠成纤维细胞系(L929 cells)进行了培养。Parental TC-1 细胞的上清刺激了 L929 成纤维细胞向免疫抑制CAF样细胞转变，同时其 TGFβ-inducible genes, 包括 LRRC15, POSTN, BMP7 和 ID1/3 的表达上升。而ko-FABP5 细胞培养的成纤维，这些基因的表达显著下降 (Fig. 7i)。这些结果提示 MP6 tumors produce FABP5-dependent TGFβ activity promoting CAF state transition to drive immune exclusion。
最后，作者探究了是否在体内抑制 FABP5可以影响肿瘤生长和T细胞浸润。与预期一致，FABP5-IN-1 显著降低了肿瘤负荷，增加了CD4和CD8T细胞浸润 (Fig. 7j–l and Extended Data Fig. 10j,k)。此外，ko-FABP5 在C57BL/6 鼠（而不是免疫缺陷BALBc裸鼠）中几乎完全阻止了肿瘤形成 (except for mouse B1) (Fig. 7m,n and Extended Data Fig. 10l)。尽管肿瘤在 B1 中生长，其 CD4 和 CD8 T 细胞浸润也显著更多。这些结果提示FABP5 在介导 immune exclusion 中存在重要作用。

Fig 7

综上所述，该研究利用空间多组学包括单细胞RNA测序、空间转录组学和空间蛋白质组学，系统地描绘了CSCC肿瘤的高分辨空间图谱。探索了CSCC的肿瘤异质性，为其他鳞状恶性肿瘤的研究提供了基础。同时，揭示了CSCC中MP6状态肿瘤通过FABP5介导的TGFβ信号通路重塑免疫微环境并逃避免疫的机制，为宫颈癌和鳞状细胞癌的免疫联合治疗提供了潜在靶点和依据，也为空间多组学解析肿瘤免疫微环境复杂性提供了有力研究范式。

思路：

1. 发现特异性肿瘤模块（单细胞数据）
   part 1：总体单细胞图谱+细胞注释
   part 2-3：对肿瘤细胞进行NMF得到3个重要肿瘤细胞表达模式：MP6 (Epi-cytokeratin) ，MP7 (Epi-Imm) 和MP8 (Epi-Sen)。且MP6和MP7与免疫微环境中显著TIME相关。
2. MP6和MP7与TIPs之间存在密切关系（空转数据）
   part 4：使用空转的数据将肿瘤样本分为三种TIP (tumor immune phenotype)：infiltrated TIP、excluded TIP和desert TIP。而 the excluded/desert CSCCs 存在更高比例的 MP6 细胞，而且infiltrated CSCC 存在更高比例的 MP7 细胞。
   part 5：空间转录组数据提示MP6和MP7在空间上互斥。
   part 6：而且作者发现的免疫相关MP7与此前的immune-hot存在差别
3. MP6周围的myCAF存在显著TGFβ活化，介导免疫抑制（空间蛋白组数据）
   part 7：空间蛋白组数据结合单细胞和空间转录组提示MP6存在TGFβ信号激活，且其活化主要位于肿瘤边缘区。且MP6特异性基因在immune poor ROI中更高。
   part 8：单细胞对成纤维的亚群细分提示免疫抑制性CAF-MMP11（也就是myCAFs）存在显著TGFβ活化，结合空转数据提示myCAF主要位于MP6 spot周围。
4. MP6/7的临床意义
   part 9：配对RNAseq队列+治疗队列的缓解情况
5. MP6特征基因FABP5的作用（类器官+敲除鼠+抗体治疗）