pyrE/pyrF正负筛选的原理及应用

• 

  Partial steps of the pyrimidine de novo biosynthesis pathway

巧记方法：2个基因，1一个产物，1个类似物，简称"211"

1. 嘧啶合成通路(Pyrimidine Biosynthesis Pathway)

1. pyrE基因：编码乳清酸磷酸核糖转移酶 （OPRTase），能够催化乳清酸（Orotic acid）转化为正常产物乳清酸核苷-5’-单磷酸（OMP）；
2. 随后，由pyrF基因编码乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶（OMPDCase），催化OMP转变为尿苷-5’-单磷酸（5-UMP）。

2. 重要产物
Uridine 5'-monophosphate (5'-UMP) 是一种单磷酸盐形式的 UTP，可从从头途径或体内核苷酸和核酸的降解产物获得，是哺乳动物乳中的主要核苷酸类似物，所以，pyrE、pyrF基因缺失突变的细胞无法合成尿嘧啶（Uridine），就会引起细胞死亡。如果培养基中补充尿嘧啶（Uridine），就可以继续存活（称作尿嘧啶营养缺陷型）。

3. 有毒类似物
5-氟乳清酸（5-FOA） 是嘧啶类似物，当加入培养基后，通过pyrE、pyrF的催化作用，最终转化为5-氟尿苷-5’-单磷酸（5-FUMP），这玩意在细胞内积累后会导致细胞死亡（就当是氟中毒吧）。

所以：

1. 该基因存在（WT），如果在培养基中添加5-FOA会被转化为5-FUMP，导致细菌死亡（像喝了毒药一样）。
2. 该基因缺失，细胞无法从头合成尿嘧啶，导致细菌死亡（这是釜底抽薪啊）

反观：

1. 突变菌株（▲pyrE或▲pyrF），若在培养基中同时提供5-FOA和Uridine，Uridine得到补充（自身已无法合成），并且细胞不能将培养基中的5-FOA转化为5-FU，细胞反而能够存活。

因此：

pyrE/pyrF基因可作为正向(含有pyrE/pyrF生存)和负向(含有pyrE/pyrF基因死亡)筛选标记。

应用案例一

1.1 链霉菌基因组中删除pyrF基因和鉴定pyrF缺陷突变体

image.png

导入pyrF基因上下游同源臂序列，利用双重组交换原理敲除pyrF
1.通过apramycin筛选出成功导入质粒的菌株；

2. 同源臂之间发生重组交换，可以删除pyrF基因，然后施加5-FOA+Uracil，只有发生突变的菌株才能存活下来；

image.png

1.2 在▲pyrF菌株的基础上再次敲除otcR基因，pKC1132-otcRDM1（含有表达pyrF基因）
1.通过apramycin筛选出成功导入质粒的菌株；
2.将携带有互补基因pyrF的敲除质粒（otcR）导入到尿嘧啶营养缺陷型宿主（ΔpyrF）中，只有发生单交换重组的突变株，才能在缺少尿嘧啶的基本培养基中生长；

3. 将发生单交换的突变株接种到含有5-氟乳清酸（5-FOA）的基本培养基中，只有发生第二次同源重组，且被敲除的靶基因（otcR）、pyrF基因及质粒骨架发生重组丢失的突变株才能在含有5-氟乳清酸的培养基中生长。
   经过两步筛选，快速、高效实现靶基因的敲除。

应用限制：
基于pyrF反选标记的基因敲除系统，包括一个尿嘧啶营养缺陷型宿主（ΔpyrF）和一个携带互补基因pyrF的非自主复制型的敲除载体（pKC1132-pyrF）。

应用案例二

2.1 CRISPR/Cas9n-AID base editing system突变pyrF
在添加尿嘧啶的5-FOA培养基中，携带pyrF突变基因的菌能正常生长，而WT并不能存活。
可以作为检测基因编辑效率的方法。

image.png

参考资料：

1. pyrEF双筛系统介绍
2. Development of a pyrF-based counterselectable system for targeted gene deletion in Streptomyces rimosus