pyrE/pyrF正负筛选的原理及应用

  • Partial steps of the pyrimidine de novo biosynthesis pathway

巧记方法:2个基因,1一个产物,1个类似物,简称"211"

1. 嘧啶合成通路(Pyrimidine Biosynthesis Pathway)

  1. pyrE基因:编码乳清酸磷酸核糖转移酶 (OPRTase),能够催化乳清酸(Orotic acid)转化为正常产物乳清酸核苷-5’-单磷酸(OMP)
  2. 随后,由pyrF基因编码乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶(OMPDCase),催化OMP转变为尿苷-5’-单磷酸(5-UMP)

2. 重要产物
Uridine 5'-monophosphate (5'-UMP) 是一种单磷酸盐形式的 UTP,可从从头途径或体内核苷酸和核酸的降解产物获得,是哺乳动物乳中的主要核苷酸类似物,所以,pyrE、pyrF基因缺失突变的细胞无法合成尿嘧啶(Uridine),就会引起细胞死亡。如果培养基中补充尿嘧啶(Uridine),就可以继续存活(称作尿嘧啶营养缺陷型)。

3. 有毒类似物
5-氟乳清酸(5-FOA) 是嘧啶类似物,当加入培养基后,通过pyrE、pyrF的催化作用,最终转化为5-氟尿苷-5’-单磷酸(5-FUMP),这玩意在细胞内积累后会导致细胞死亡(就当是氟中毒吧)。

所以:

1. 该基因存在(WT),如果在培养基中添加5-FOA会被转化为5-FUMP,导致细菌死亡(像喝了毒药一样)。
2. 该基因缺失,细胞无法从头合成尿嘧啶,导致细菌死亡(这是釜底抽薪啊)

反观:

1. 突变菌株(▲pyrE或▲pyrF),若在培养基中同时提供5-FOA和Uridine,Uridine得到补充(自身已无法合成),并且细胞不能将培养基中的5-FOA转化为5-FU,细胞反而能够存活。

因此:

pyrE/pyrF基因可作为正向(含有pyrE/pyrF生存)和负向(含有pyrE/pyrF基因死亡)筛选标记。


应用案例一

1.1 链霉菌基因组中删除pyrF基因和鉴定pyrF缺陷突变体

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导入pyrF基因上下游同源臂序列,利用双重组交换原理敲除pyrF
1.通过apramycin筛选出成功导入质粒的菌株;

  1. 同源臂之间发生重组交换,可以删除pyrF基因,然后施加5-FOA+Uracil,只有发生突变的菌株才能存活下来;
image.png

1.2 在▲pyrF菌株的基础上再次敲除otcR基因,pKC1132-otcRDM1(含有表达pyrF基因)
1.通过apramycin筛选出成功导入质粒的菌株;
2.将携带有互补基因pyrF的敲除质粒(otcR)导入到尿嘧啶营养缺陷型宿主(ΔpyrF)中,只有发生单交换重组的突变株,才能在缺少尿嘧啶的基本培养基中生长;

  1. 将发生单交换的突变株接种到含有5-氟乳清酸(5-FOA)的基本培养基中,只有发生第二次同源重组,且被敲除的靶基因(otcR)、pyrF基因及质粒骨架发生重组丢失的突变株才能在含有5-氟乳清酸的培养基中生长。
    经过两步筛选,快速、高效实现靶基因的敲除。

应用限制:
基于pyrF反选标记的基因敲除系统,包括一个尿嘧啶营养缺陷型宿主(ΔpyrF)和一个携带互补基因pyrF的非自主复制型的敲除载体(pKC1132-pyrF)。

应用案例二

2.1 CRISPR/Cas9n-AID base editing system突变pyrF
在添加尿嘧啶的5-FOA培养基中,携带pyrF突变基因的菌能正常生长,而WT并不能存活。
可以作为检测基因编辑效率的方法。

image.png

参考资料:

  1. pyrEF双筛系统介绍
  2. Development of a pyrF-based counterselectable system for targeted gene deletion in Streptomyces rimosus

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作者:dingding
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来源:TechFM
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