1. Author

Adi Barzel

Adi Barzel实验室将专注于使用病毒载体的基因治疗。将应对从癌症到病毒感染和糖尿病的各种疾病。设计安全有效的基因疗法将生物化学和分子生物学的挑战与生理学、免疫学、病毒学等方面的挑战相结合。同时Adi Barzel将专注于基因组编辑——基因组的位点特异性操作。特别是，Adi Barzel将使用病毒载体不仅将DNA递送到所需的细胞，而且促进基因靶向到所需基因座。研究基因靶向的机制，以便更好地为我们的治疗事业操纵它。实验室探索以下方向：1. 癌症免疫疗法：嵌合抗原受体（CARs）的基因靶向2. 对抗病原性感染：广泛中和抗体的基因靶向3. 治疗糖尿病：转分化和免疫逃避的基因靶向4. 利用病毒载体阐明基因靶向机制5. 设计通过同源重组提高基因靶向率的方法。

2. Background

2.1 腺相关病毒

腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是一类无法自主复制的二十面体微小病毒。通常情况下，只有在辅助病毒的参与下，才能进行复制。腺相关病毒（AAV）载体系统是对腺相关病毒进行优化的一种基因传递系统。AAV重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞，包装成病毒颗粒。纯化后，转导进入宿主细胞，线性双链DNA基因组以游离DNA的形式存在于细胞核中。辅助质粒能够代替辅助病毒，帮助AVV实现自我复制，从而提高载体系统的生物安全性。

目前大多数基因治疗用rAAV以AAV2基因组为骨架，基因组全长为4679bp，两端为145bp的反向末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR）, ITR序列之间为AAV病毒的编码区，含有两个开放阅读（ORF），左侧ORF编码4种序列相互重叠的基因，分别编码Rep78、Rep68、Rep52、Rep40等四种参与病毒基因复制的蛋白，右侧ORF编码3种Cap蛋白，分别是VP1、VP2、VP3三种组成病毒衣壳的蛋白，嵌入部分编码1种AAP蛋白。

病毒基因组中三个启动子根据它们在基因组中所处的位置被命名为p5、p19、p40，其中p5、p19负责调控Rep蛋白的表达，p40负责调控Cap蛋白的表达，三个启动子合成的mRNA共用一个polyA位点。

腺相关病毒在感染细胞后，需要辅助病毒的帮助才能进入裂解期，辅助病毒的感染可以在AAV感染之前、同时或之后进行。在没有辅助病毒的情况下，腺相关病毒基因的表达会受到限制，此时一部分腺相关病毒DNA会在ITR以及Rep蛋白的帮助下整合到人类19号染色体上，而对于研究中常用的重组AAV，由于其基因组不含Rep基因，因此将转导后AAV基因组以游离体的形式存在于细胞中，有助于转基因在细胞中的长期表达。

腺相关病毒的外观与基因组

2.2 载体克隆启动子（Promoter）

启动子是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列，它含有RNA 聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。但有一些启动子(如tRNA启动子)位于转录起始点的下游,这些DNA序列可以被转录。启动子的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子本身并不控制基因活动，而是通过转录(transcription)因子结合控制基因活动的。

1.CMV启动子作为最为广泛使用的启动子，适合在肿瘤细胞、肌肉、肝脏等体细胞或者贴壁细胞的表达，而不适合大多数干细胞、悬浮细胞及原代细胞的表达；

2.EF1α启动子适合干细胞、原代细胞、造血细胞等的表达，在常用细胞如HEK293、肿瘤等细胞系中弱于CMV；

3.CAG启动子在不少细胞系，诸如免疫细胞、体细胞，有不次于CMV的表达效率，也是基因表达的一个较优选择的启动子。

2.3 CD19

CD19是B细胞的生物标志物，通过B细胞受体（BCR）调节B细胞的发育增殖和分化并介导T细胞对靶细胞的杀伤。CD19与CD21、CD81形成B细胞共同受体复合物，该复合物减少BCR介导的B细胞激活阈值，其中CD21起桥梁作用，CD81调节CD19的表达，CD19则发挥主要的信号传导作用。此复合物在B细胞激活过程中解离，使得CD19能够在细胞膜中自由扩散并与BCR相互作用。CD19与BCR和其他表面分子结合，可以直接和间接地募集和结合各种下游蛋白激酶，如Src、Ras、PI3K等。Src蛋白在细胞表面聚集增强BCR信号。BCR激活后，CD19还通过募集和激活PI3K和下游Akt激酶来增强BCR诱导的B细胞扩增信号传导。

CD19与CD21、CD81形成B细胞共同受体复合物促进B细胞增殖

3. Results

该研究使用两种腺相关病毒载体（AAV）同时递送CRISPR-Cas9 基因编辑系统和靶向免疫球蛋白基因的修复模板，直接编辑小鼠内源 B细胞的免疫球蛋白基因位点，有效地在体内修饰 B 细胞，使之能产生针对 HIV 病毒的中和抗体，让一次性注射治疗艾滋病成为可能。

多年以来，科学家们在治疗 HIV 感染时一直面临一个十分棘手的问题——HIV 在人体中变异迅速，极易产生耐药性。令人兴奋的是，2011年Michel Nussenzweig团队在一名 HIV 感染者体内分离出了一种HIV 广泛中和抗体——3BNC117

然而，尽管针对 HIV 的强效、广泛中和抗体（bNAb）可以保护机体免受感染，但众多的艾滋病候选疫苗的临床试验最终无一不以失败告终，这提示我们想要通过传统的免疫方法实现对 HIV 的免疫是十分困难甚至是不可能的，必须走出新的道路。对此，如果能通过CRISPR 技术直接编辑免疫球蛋白基因来重编程体液免疫，使之产生靶向特定病原体（如HIV病毒）的中和抗体，那将是一种里程碑式的革新。

在这项最新研究中，研究团队设计了两种重组腺相关病毒（AAV）：一种编码CRISPR-Cas9 基因编辑系统，包括 CMV/SFFV 启动子驱动的 SaCas9 和 U6 启动子驱动的sgRNA；另一种编码靶向免疫球蛋白基因的 HIV-bNAb-3BNC117 同源性定向修复模板（HDRT）。

载体构建策略

研究人员使用各种 HIV 包膜糖蛋白（Env）为基础的免疫原免疫小鼠，以扩大激活细胞的数量，6天后通过静脉注射将这两种重组 AAV 地送到小鼠体内。经过几次相同的 HIV-Env 增强免疫后，小鼠的血清中开始表达广泛中和抗体，并且可以中和3BNC117 敏感的 HIV 毒株。

小鼠免疫时间线

紧接着，研究团队通过高通量测序分析了基因编辑效果。正如预期的那样，早期可在小鼠的肝脏和血液中发现 AAV 基因组的强烈富集，随着时间的推移，在肝脏中 AAV 拷贝数减少，而在免疫小鼠的淋巴结和骨髓中增加，这表明在这些组织中B细胞克隆扩增正在进行。

注射AAV后130天，在免疫小鼠的淋巴组织中发现了体内工程B细胞

研究小组还通过 CHANGE-seq 评估了脱靶编辑的程度，结果显示，95%的 Cas9 诱导的切割是靶标特异性的，并且所有主要脱靶编辑位点都位于基因间或内含子区域。为了防止在细胞中的脱靶编辑，研究团队等将驱动 Cas9 表达的 CMV/SFFV 启动子替换为B细胞特异性 CD19 启动子。除此之外，他们还将编码 gRNA 的元件转移到含 HDRT 的AAV 中，这样只有同时转导了两种 AAV 的细胞才能被编辑。这种新设计在保持编辑效率和血清抗体水平的同时，显著降低了肝脏中的 Cas9 表达和非特异性切割。

脱靶切割分析显示了较高的安全性

总而言之，这项研究开发了一种实现HIV 免疫的新方法——通过 CRISPR 技术直接编辑免疫球蛋白基因来重编程体液免疫，诱导免疫系统产生对抗 HIV 的广泛中和抗体——3BNC117，中和 3BNC117 敏感的 HIV 毒株。作者认为可以从以下几方面进行优化：（1）将bNAb编码为单链以减少bNAb 重链与内源性轻链的错配，从而提高安全性和有效性；（2）使用更特异性的核酸酶和使bNAb基因之前有剪接受体而不是启动子，可以进一步提高安全性，以减少脱靶整合的表达；（3）在感染HIV样感染的非人类灵长类动物中对该方法进行评估；（4）将该方法应用在其他持续性感染以及自身免疫性疾病、遗传性疾病和癌症中。