10+SCI,生信分析筛选基因+实验验证,可以作为模板文章学习!

大家好!今天给大家介绍一篇2023年1月发表在International Journal of Biological Sciences(IF=10.75)杂志上,题目为《 Validation of ESM1 Related to Ovarian Cancer and the Biological Function and Prognostic Significance 》,本篇文章结合生信分析和实验,从筛选到验证,得到了与OC的发生、发展密切相关的,有望成为OC新的生物标志物和治疗靶点——ESM1。

关于生信筛选基因结合实验验证,非常适合有实验条件的朋友。目前来说生信结合实验会比单纯简单的实验文章更好发,也是近些年10分上下实验文章的大趋势。肿瘤和非肿瘤均适合。

摘要

背景:卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是一种严重的妇科恶性疾病,其早期诊断和治疗仍是一个巨大的挑战。基于R语言的GEO和TCGA数据库,使用生物信息学分析工具分别确认内皮细胞特异性分子1(ESM1)。ESM1已被证明在多种癌症类型中上调,但ESM1促进OC的致癌机制在很大程度上仍然未知。

方法:本研究采用WGCNA和随机生存森林变量筛选法筛选OC差异表达基因(DEGs)中的ESM1。接下来,通过PCR和IHC确认OC样品中ESM1的mRNA和蛋白水平。进一步证实了ESM1水平与OC患者的临床数据(包括FIGO分期、淋巴结转移和复发)之间的相关性。ESM1在OC的发展中的作用进行了探讨,在体内和体外的几个功能实验。通过生物信息学和实验分析,进一步阐明了ESM1的分子机制。

结果:ESM1在OC中显著上调,与PFS呈正相关,与OS呈负相关。在多个实验中,ESM1敲低抑制细胞增殖、凋亡逃逸、细胞周期、血管生成、迁移和侵袭。此外,GSVA发现ESM1与Akt通路相关,我们的结果支持这一预测。

结论:ESM1与OC的发生、发展密切相关,有望成为OC新的生物标志物和治疗靶点。

图 1 文章技术路线图

  1. 1. 关键基因的确认

作者在GEO数据库收集了2组卵巢癌微阵列数据(GSE66957和GSE54388),得到了与OC患者相关的差异基因集(图2 A&B);通过WGCNA确定了绿松石(GSE66957)和蓝色模块(GSE54388)为枢纽基因集(图2 G&H);将枢纽基因集和差异基因集进行Venn分析,共得到326个关键基因,并对这些关键基因进行了GO和KEGG分析,并构建了PPI网络。

图 2通过差异基因分析和WGCNA鉴定关键基因

  1. 2. 核心基因的鉴定和验证

通过随机生存森林算法,对关键基因进行特征选择,最终筛选出三个基因ESM1,CENPH和HIST1H2AE(图3A);对这三个基因进行GSVA分析表明雌激素反应,E2F靶点是CERPH介导的主要途径。ESM1主要介导同种异体移植排斥反应和精子发生途径。UV响应dn和氧化磷酸化是HIST1H2AE表达的两种主要富集途径之一(图3C);此外,Genemania网络还表明,这三个基因在多种生物学功能上具有密切的相互作用,包括核小体组装、染色质组装、核小体组织和蛋白质-DNA复合物组装(图3D)。

图 3 关键基因的验证

  1. 3. OC免疫浸润和遗传改变相关核心基因

作者在TCGA数据库收集了379份OC癌症标本,并提取了ESM1,CENPH和HIST1H2AE核心基因的临床关联数据。结果表明,与病理1级OC组织相比,病理2级OC组织中ESM3的表达增加。然而,CENPH和HIST1H2AE的表达与OC的病理分级无显著相关性。为了阐明免疫微环境与三个基因之间的关系,作者基于TIMER数据库提取了三个基因的水平谱,该图谱表明了不同免疫细胞类型中的表达水平不同。此外,他们进一步分析了三个基因的水平与B细胞,CD8+T细胞,CD4+T细胞,巨噬细胞,中性粒细胞和树突状细胞浸润水平的关联。这些结果表明,这三个基因与OC患者的免疫浸润进展密切相关,特别是在HIST2H1AE和ESM1中。

为了确定OC的体细胞突变频率中是否存在三个基因,作者在cBioPortal数据库提取了Oncoprint谱CENPH、ESM1和HIST1H2AE的体细胞突变频率分别为6%、8%和17%(图4A),此外,为了显示免疫浸润与癌变之间存在显著的相关性,作者研究了这三个基因的TMB(肿瘤突变率),结果表明,在OC中ESM1高表达与更高的TMB相关( p = 6.343e-04 ) (图4B )。以上结果表明免疫检查点抑制剂对ESM1高表达的OC患者可能更有效、更敏感。

作者利用TIDE算法寻求免疫治疗的效率的可能性。除此之外,作者还评估了两种基因表达亚型(低或高表达水平)对三种化疗药物和两种EGFR-TK抑制剂的反应:顺铂、多西他赛、紫杉醇、吉非替尼和厄洛替尼。利用基于GDSC细胞系数据的岭回归预测模型。结果显示这五种药物的IC50介于低和高水平ESM1之间,其中低ESM1可能对化疗(紫杉醇)和免疫学疗法(吉非替尼和厄洛替尼)更敏感。然而,在用五种药物治疗后,在CENPH和HIST1H 2AE中未观察到这种差异(图4C)。所以,具有高水平ESM1的OC患者是比EGFR-TK抑制剂(厄洛替尼和吉非替尼)和紫杉醇更好的免疫治疗候选者。基于TCGA数据库提取OC中这些核心基因的DNA甲基化谱,其显示与正常卵巢组织相比,OC中甲基化水平增加(图4D)。

图 4 三个关键基因的表观遗传修饰和遗传改变

4. ESM1的异位表达与OC的临床参数相关

作者首先使用TCGA和GEO数据库来确认OC患者中ESM1的表达,表明ESM1在OC中明显增强(图5A)。并收集了30对来自接受手术肺叶切除术的OC患者的邻近正常卵巢组织研究OC中核心基因的mRNA水平。qRT-PCR还显示,与相应的癌旁组织相比,OC中的ESM1显著增加(图5A)。基于TCGA数据库,作者还发现ESM1在OC诊断中具有高度的敏感性和特异性,这表明ESM1是OC患者的优良诊断标志物。此外,作者利用免疫组化染色来检测OC中的这些蛋白质水平。结果表明,与相应的癌旁组织和正常卵巢组织相比,ESM1的表达在OC组织中增加(图5B)。此外,作者还发现这些异位表达的蛋白与OC的一些临床参数密切相关,如FIGO分期、淋巴结转移和复发。提示ESM1可能在OC的发生发展中起重要作用。

图 5 ESM1在OC患者中的表达水平和预后价值

作者还基于KM-图数据库验证了ESM1在OC患者中的预后意义,其表明ESM1水平的总生存期(OS)与OS患者预后负相关(图5C),但ESM1水平的无进展生存期(PFS)与OS患者预后负相关(图5C)。与OC患者的预后正相关(图5D)。此外,作者还发现ESM1在早期OC患者中显著增加,这表明与ESM1 mRNA低表达的OC患者相比,ESM1 mRNA高表达的早期OC患者具有更好的临床治疗机会以获得更好的预后。作者使用TCGA数据库进一步分析了ESM1的预后价值。ESM1 mRNA表达与总生存率显著正相关,特别是在具有淋巴浸润、G3组织学分级、年龄>60岁和FIGO III期的OC患者中。与双侧OC患者相比,ESM1表达在单侧OC患者中也更高。在DSS和OS事件中,存活的OC患者具有比死亡事件的这些OC患者更高的ESM1 mRNA表达。最后,作者证实了ESM1在多种OC细胞系中的表达水平。qRT-PCR和蛋白质印迹显示,与正常卵巢细胞(HOSE)相比,OC细胞系中的ESM1 mRNA和蛋白质水平显著增加,尤其是在SKOV3和A2780细胞中(图5C&D)。

图 5 ESM1在OC患者中的表达水平和预后价值

  1. 5. ESM1敲低对OC进展的影响

为了验证ESM1的病理生理功能,作者使用RNA干扰来抑制内源性ESM1表达。WB结果显示shRNA的最佳抑制效果是shRNA#1(图6A)。我们证实了ESM1对OC增殖的影响,这表明抑制ESM1可以显著降低体外增殖能力(图6B&C)。此外,作者还发现ESM1表达敲低显著抑制A2780和SK 0 V3细胞系中的DNA复制水平(图6D)。这些结果表明,ESM1基因敲低可显著抑制OC细胞的增殖能力。然后,作者通过流式细胞术证实了ESM1对A2780和SKOV3细胞凋亡水平的影响。结果显示,当ESM1缺陷时,两种OC细胞系中的凋亡水平明显增加(图6E)。此外,ESM1 KD明显诱导细胞周期停滞在Gl期(图6F)。

图 6 ESM1对OC增殖,细胞周期进程和细胞凋亡的影响

作者还检测了ESM1基因敲低对OC细胞迁移和侵袭的影响。OC迀移和侵袭被ESM1抑制明显减弱(图7A和B)。ESM1敲低后,抑制MMP9表达,但增强TIMP表达以抑制OC细胞迀移和侵袭(图7C)。

图 7 ESM1 KD可阻断OC迁移、侵袭和血管生成

  1. 6. ESM1缺陷在体内和体外抑制OC血管生成

作者使用源自ESM1 KD或OE转染后的OC细胞的条件培养基(CM)孵育HUVEC 6小时,其用于进一步的管形成分析、增殖分析、迀移分析(图7D)。管形成分析显示,与NC和载体组相比,ESM1缺陷可诱导肿瘤新血管形成抑制(图7E和F)。

图 7 ESM1 KD可阻断OC迁移、侵袭和血管生成

伤口愈合测定显示,在ESM1 KD后,源自OC细胞的CM中HUVEC的迀移能力显著降低(图8A)。增殖试验还表明,与NC和载体组相比,具有源自ESM1 KD OC细胞的CM的HUVECS具有较低的增殖能力(图8B和C)。此外,CAM分析用于进一步证实ESM1在体内对OC血管生成的分子作用,与NC和Vector组相比,ESM1 KD具有明显降低的新血管形成密度(图8D)。在斑马鱼模型中也观察到ESM1抑制的作用,其显示ESM1 KD可显著抑制体内新血管的形成(图8E)。这些结果表明,ESM1基因敲减可以减弱OC细胞的血管生成能力。

图 8 ESM1敲低可在体外和体内抑制OC细胞血管生成

  1. 7. ESM1抑制对体内肿瘤生长的影响

为了进一步证实ESM1在体内对OC的作用,将用载体或ESM1 KD转染的A2780细胞皮下注射到裸鼠中。我们发现ESM1抑制组中的肿瘤体积和重量明显小于载体组(图9A-C),这表明ESM1可以促进OC细胞体内的致瘤性。 IHC染色显示ESM1抑制可抑制VEGF-A、PCNA和Cdc 25 A的表达(图9D),表明ESM1可通过促进增殖、细胞周期和血管生成来加速OC进展。

图 9 ESM1抑制可以抑制体内OC细胞的生长

  1. 8. EMS1敲低抑制人OC细胞中Akt/mTOR/ HIFα通路

根据GSVA结果(图3C),作者证实了ESM1对PI3
K/Akt途径的致癌遗传效应。蛋白质印迹分析显示ESM1抑制可使AKT途径失活并进一步降低Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、HIF-α、eNOS和MMP9的表达,这可被Akt活化剂(SC-79)逆转(图10A)。此外,我们通过ELISA检测了这些细胞组中的VEGF水平(图10B),这表明ESM1可以通过Akt途径增加VEGF的水平。总之,ESM1/Akt轴在OC细胞增殖和血管生成的调节中起关键作用(图10C)。

图 10 ESM1通过Akt/mTOR途径加速OC的发育和进展

    1. ESM1过表达(OE)通过Akt途径加速OC细胞的增殖、迁移和血管生成
      

此外,作者构建了过表达ESM1蛋白的CAOV3细胞系和用空载体转染的NC CAOV3细胞系。通过蛋白质印迹检测ESM1水平(图11A)。MTT分析显示ESM10E可显著增加CA0V3细胞的存活力(图11B)。EdU分析还显示ESM1可以加速CA0V3细胞中的DNA复制(图11C)。此外,我们发现ESM1可增强OC 迀移和侵袭能力(图11D和E),这明显增加MMP9但降低TIMP蛋白表达(图11F)。与NC相比,具有高水平ESM1的CAOV3细胞可诱导肿瘤新生血管抑制和载体组(图11G)。此外,ESM1的这些分子生物学效应可被Akt抑制剂LY 294002逆转(图11A-G),但ESM1表达不受Akt抑制剂LY 294002的影响(图11F)。此外,我们还发现ESM1可以增强用CA 0 V3的CM培养的HUVEC中新血管的形成,其可以被LY 294002挽救(图11 H)。进一步的实验表明,由ESM 10 E-CA 0 V3细胞分泌的高水平的ESM1可以增强HUVEC的增殖和迀移能力(图12 A-C)。CAM和斑马鱼模型分析用于进一步证实ESM1对体内OC血管生成的分子作用,与NC和Vector组相比,ESM1OE具有明显增加的新血管形成的密度和数量,而LY 294002显示出显著降低的微血管形成的密度和数量(图12 D和E)。这些结果表明ESM 1可以通过Akt途径促进OC进展。

图 11 ESM1过表达通过Akt途径对OC生物表型的影响

小结

本研究首次系统阐明了ESM1在OC进展中的表达、功能及其分子机制。并且证实了ESM1可以通过调节Akt/mTOR通路增加细胞增殖、凋亡逃逸、血管生成、迁移和侵袭。因此,ESM1可能是OC患者的诊断标志物和潜在的治疗靶点。

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作者:cc
链接:https://www.techfm.club/p/100997.html
来源:TechFM
文章版权归作者所有,未经允许请勿转载。

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