文献阅读：使用proximity barcoding assay分析单个外泌体表面蛋白

文献信息

标题：Profiling surface proteins on individual exosomes using a proximity barcoding assay

DOI(url): Profiling surface proteins on individual exosomes using a proximity barcoding assay | Nature Communications

日期及杂志：26 August 2019, Nature Communications

作者及单位：Di Wu, Department of Immunology, Genetics and Pathology, Science for Life Laboratory, Uppsala University, SE-75 185 Uppsala, Sweden

文献概述(这篇文献的结论是什么？)

外泌体参与了许多生物学过程，它们可能作为重要的疾病标志物。外泌体上的表面蛋白携带着有关其来源组织的信息。由于外泌体的异质性，人们希望对它们进行单独研究，但这迄今仍是不切实际的。本文展示了一种近端依赖的条形码分析方法，利用抗体DNA偶联物和二代测序来分析单个外泌体的表面蛋白。本文首先使用人工链霉亲和素-寡核苷酸复合物验证了该方法，然后分析了来自人体体液或细胞培养基的单个外泌体上表面蛋白质的可变组成。不同来源的外泌体可以由表面蛋白的特定组合及其丰度来表征，因此可以在混合样本中分别对外泌体进行定量，并将其作为与疾病相关的组织特异性标志物。

文献结果(每个结果的图片详细解读)

1、PBA的设计和流程

PBA探针是通过将抗体与DNA寡核苷酸结合制备的，这些DNA寡核苷酸包括一个8nt的蛋白标签(proteinTag)，用于识别目标外泌体表面蛋白，以及一个8nt随机唯一分子标识符(UMI)序列，在这里称为分子标签(moleculeTag)，用于在PCR扩增后区分单个蛋白质分子(图1a)。对含有15 nt随机DNA序列的环状DNA分子(complexTag)进行滚环扩增得到RCA产物，每个RCA产物包括数百个相同的独特complexTag(图1b)。

在PBA中，外泌体与PBA探针在溶液中混合，在96孔微滴孔中被稀疏捕获。然后添加稀释的RCA产物，通过PBA探针与RCA产物杂交，与单个外泌体相互作用。结合到相同外泌体上的PBA探针通过DNA聚合酶介导的延伸接近，结合来自附近RCA产物的相同complexTag(图1c)。接下来，扩增延伸产物制备测序文库。外泌体上没有遇到RCA产物的寡核苷酸和分离的RCA产物都不能产生可扩增的产物。扩增产物测序后，每个样品的reads通过complexTags和proteinTags进行分类，以鉴定单个外泌体上参与的蛋白。通过计算共享相同复合物标签的每个蛋白质标签的不同分子标签的总数，可以鉴定和定量样品中来自单个外泌体的所有检测到的蛋白质分子。

Fig1

2、使用单独或混合孵育系统验证PBA

为了确定PBA可以正确识别蛋白质复合物的成员，首先通过允许链霉亲和素(STV)结合生物素化寡核苷酸的组合来制备人工复合物(图2a)。四聚链亲和素分子与四种不同的生物素化寡核苷酸孵育，要么单独，要么在所有四种寡核苷酸的混合物中。链霉亲和素和生物素化寡核苷酸以1:10或10:1的摩尔比组合。(图2a)表示观察到的具有不同数量的proteinTag和moleculeTag的复合物的数量的饼状图。当寡核苷酸过量时，根据每个复合物中蛋白标签的数量对与2、3或4个分子标签孵育的单独或混合寡核苷酸的复合物数量进行分组。计算了混合样品的理论比值(图2b)。

Fig2

在确定PBA可以识别链霉亲和素模型系统中的复合物成员后，下一步研究了该方法在单个外泌体上分析表面蛋白的性能。利用CD9和CD63抗体验证PBA在外泌体上的作用。(图3a)单独孵育:从K562细胞系分离的外泌体分别与两组不同的PBA探针孵育，然后将它们汇集在一起进行PBA。(图3b)混合孵育:在进行PBA前，外泌体与四种不同的PBA探针孵育。在与单独探针组的反应中，只有不到5%的外显体带有来自两个不同探针组的PBA探针，而绝大多数外泌体同时带有来自同一探针组的CD9和CD63标记。相比之下，在混合探针组的反应中，外泌体被两种探针组的探针标记。这再次证明了PBA能够以最小的错误识别风险分析单个外泌体，这对于表征生物样本中的外泌体种群非常重要，作为评估其独特诊断潜力的基础。

Fig3

3、PBA分析不同来源单个外泌体的表面蛋白

接下来，本文应用PBA研究了18种不同人类来源的38种不同人类蛋白(40个标记蛋白)在外泌体上的存在。(图4a)热图表示在不同来源的外泌体上发现的蛋白质总量的log(moleculeTag + 1)。(图4b)根据单个外泌体的蛋白质组成，用t-SNE可视化显示鉴定的具有一种蛋白质类型、两种蛋白质类型和三种或三种以上蛋白质类型的外泌体，并用颜色和形状表示每个外泌体的来源。对于一些区域，如图4b中虚线圈所示，来自特定样本来源的外泌体占主导地位。这表明当识别更多的表面蛋白时，不同来源的外泌体可以更好地区分。

Fig4

根据PBA显示的表面蛋白组合，对不同来源的外泌体进行定量。(图5a)与来自血清的外泌体(灰色)相比，选择K562外泌体(橙色)或前列腺体(蓝色)的蛋白质组合，根据具有特定组合的外泌体的数量进行分类。这里显示了每个外泌体的前50个。(图5b, c)分别使用K562或前列腺体选择性组合对血清外泌体中添加的K562外泌体或前列腺体的连续稀释度进行定量。在图5b的tSNE图中用橙色和蓝色填充圆圈表示与K562或前列腺体选择性组合鉴定的外泌体，在图5c的条形图中用橙色和蓝色填充圆圈表示。每两个垂直相邻的tSNE图和两个水平相邻的条形图表示两个重复。

Fig5

文献方法(使用的生物信息学方法)

数据分析

使用bcl2fastq (Illumina)将每个样本的BCL文件转换为fastq格式。然后从每个reads的三个固定片段中提取complexTag、proteinTag和moleculeTag。只有一个count的reads从分析中删除。然后使用内部开发的Perl脚本根据complexTag、proteinTag和moleculleTag对Tags进行排序。使用内部开发的R脚本计算具有给定蛋白质组合的外泌体的数量。所采用的t-SNE算法是在R包Rtsne中实现的，pipeline中所有参数都设置为默认。

文章亮点(这篇文献的优点在哪？)

• 它允许同时分析单个外泌体上的多个表面蛋白，并在高多重水平上评估它们的蛋白质组成。这克服了传统方法的局限性，如流式细胞术和纳米等离子体传感器，它们对可以同时分析的蛋白质数量有限制。即使在单分子或分子复合物的水平上，PBA也能提高蛋白质检测的特异性和灵敏度。

我的疑问(这篇文献的不足在哪？)

• PBA的检测限取决于给定蛋白组合的特异性、测序的覆盖范围和深度，以及抗体的亲和力和选择性。

• PBA分析不一定能检测到给定外泌体上存在的所有蛋白质，因为抗体结合量不足，测序深度有限，更多的蛋白质。

和我相关(我从这篇文献里学到了什么？)

• 本文提出了一种使用邻近依赖条形码分析单个外泌体表面蛋白的方法，使用人工链亲和素寡核苷酸复合物验证了该方法，然后将其应用于分析来自人体体液或细胞培养基的外泌体表面蛋白质的组成。在应用部分，着重分析了不同表面蛋白组合，并且表明多个蛋白组合(3个)对外泌体来源溯源有一定作用