RNA聚合酶Ⅱ的招募后调控指导雌激素靶基因启动子的快速信号反应

在真核生物信号依赖性转录的经典模型中，结合DNA的激活性蛋白调节 RNA 聚合酶Ⅱ (Pol Ⅱ) 向一组靶向启动子的募集。 然而，最近的研究以及我们在此的结果表明，在特定的信号传导事件之前，Pol Ⅱ广泛分布（即“预加载 preloaded”）在许多基因的启动子处。 Pol Ⅱ 募集和 Pol Ⅱ 预加载如何适应统一的基因调控模型尚不清楚。 此外，细胞信号激活哺乳动物基因组中预载的 Pol Ⅱ 的机制仍然很大程度上未知。 我们在这里表明，雌激素信号传导的主要基因组结果是靶基因启动子处 Pol Ⅱ活性的招募后调节，可能是通过 Pol Ⅱ 磷酸化的特定变化而不是通过将 Pol Ⅱ 招募到启动子。此外，我们还发现负调控延伸因子与预载的 Pol Ⅱ结合到雌激素靶启动子上，并抑制基因表达，直到收到适当的信号。最后，我们的研究表明，预载 Pol Ⅱ 的雌激素依赖性激活促进了快速的基因调节反应，这在调节雌激素信号传导本身方面发挥着重要的生理作用。 我们的结果揭示了雌激素信号通路对招募后 Pol Ⅱ调节的广泛应用，这种调节模式可能适用于多种信号调节通路。

基因表达调控是细胞响应生理和环境信号的重要手段。 在信号依赖性转录的经典模型下，DNA 结合激活蛋白促进 RNA 聚合酶 Ⅱ(Pol Ⅱ)募集到一组目标启动子。 另一种非相互排斥的控制基因表达的机制涉及 Pol Ⅱ 活性的调节，主要通过磷酸化，在招募到靶基因后的一个步骤。在后生动物中，基因特异性研究提供了受 Pol Ⅱ 招募或 Pol Ⅱ 招募后激活调节的基因的例子，尽管主要机制仍然很大程度上未知。此外，最近的全基因组研究表明，Pol Ⅱ 在特定信号事件之前定位于许多未表达基因的启动子（即 Pol Ⅱ 是“预加载的”）。有趣的是，预加载或停滞的 Pol Ⅱ 最近被认为在调节启动子-近端核小体组装和基因表达中发挥重要作用。

目前关于预载 Pol Ⅱ在整个基因组中的作用的假设表明，它随时可以被生理或发育信号激活。这一假设的有效性以及特定信号通路激活预载 Pol Ⅱ的机制尚未在全基因组范围内直接研究。雌激素，如 17β-雌二醇 (estradiol, E2)，是信号调节转录的良好模型，因为它们通过 DNA 结合雌激素受体 (ER) 发挥作用，控制涉及生殖、发育和代谢的基因表达模式。 E2 信号传导基因激活的历史模型是基于 E2 调节基因模型开发的，涉及 E2 依赖性染色质修饰，然后招募 Pol Ⅱ 来靶向启动子。然而，这种“Pol Ⅱ招募”模型的普遍性尚未在整个 E2 调控的转录组中得到检验。

转录周期的复杂性为精细调控 Pol Ⅱ 依赖性转录反应提供了许多机会。 在转录起始之前，PolⅡ 与基因启动子处的通用转录因子形成起始前复合物 (PIC) 。启动后，Pol Ⅱ 从启动子中释放，通过基因编码区进入生产性延伸。 Pol Ⅱ Rpb1亚基羧基末端结构域（通常称为 Pol Ⅱ CTD）七肽重复序列中特定残基的磷酸化标志着从转录起始到转录延伸的转变。例如，Pol Ⅱ CTD 的丝氨酸 5 处的磷酸化(Ser5P) 通常发生在转录周期的早期。 相反，丝氨酸2 的磷酸化(Ser2P) 主要由正转录延伸因子-b (P-TEFb) 的细胞周期蛋白依赖性激酶 9 (Cdk9) 催化，通常与生产性延伸同时发生，并且主要朝向基因的 3' 末端。负延伸因子 (NELF) 和 DRB 敏感性诱导因子(DSIF) 复合物等反式作用因子协同抑制转录延伸，它们的负面影响可以通过 P-TEFb 克服。然而，最近的研究表明 NELF 也可能在转录调控中发挥积极作用。Pol Ⅱ磷酸化以及 NELF 和 DSIF 的功能如何在基因组规模上受细胞信号调节仍然很大程度上未知。

在本研究中，我们表明人类基因组中很大一部分未表达的基因（约 20%）在特定信号事件之前已预加载 Pol Ⅱ。 此外，我们的研究表明，靶启动子处雌激素信号传导的主要基因组结果是预载 Pol Ⅱ 的募集后激活，可能是通过CTD 的磷酸化，而不是 Pol Ⅱ 的募集。 该过程涉及依赖 E2 的 Cdk9 招募。 此外，我们的结果表明，交易调节因子（例如 NELF 和 DSIF）可通过预加载的 Pol Ⅱ 抑制转录，直到收到适当的信号（例如 E2）。 E2 的这种调节模式促进了快速的基因调节反应，该反应在前馈途径中发挥作用来调节整个雌激素信号传导程序。 本文描述的结果与其他最近的发现一起揭示了一种信号依赖性基因调控的新模式，该模式可能适用于多种信号调控途径。

1. Pol Ⅱ 占据不一定与基因表达相对应

为了探索人类细胞中信号调控转录的整体机制，我们使用 ChIP 与基因组微阵列（即 ChIP-chip）结合来确定 Pol Ⅱ 在基础条件下 MCF-7 人乳腺癌细胞中~18,900个启动子处的定位，在无雌激素的生长条件。 使用严格的call peak标准和较低的错误发现率，我们发现 Pol Ⅱ 与 chip 上大约一半（即 8,678个）启动子的 TSS 结合并在 TSS 处形成peak（参见补充材料中的图 S1A），与之前的结果一致。 接下来，我们使用一式三份的微阵列分析将 Pol Ⅱ 结合数据与其中 14,000 个启动子的表达信息进行匹配。 根据我们的标准，在所有三个重复中具有“存在”调用的基因被定义为明确“表达”，而在所有三个重复中具有“不存在”调用的基因被定义为明确“未表达”。 微阵列分析中表达状态不明确的基因被排除在进一步考虑之外。 通过 qRT-PCR 确认了几个“表达”和“未表达”基因的表达状态（参见补充材料中的图 S2）。 当然，我们对明确“未表达”的定义并不排除从我们研究中分析的启动子中表达低水平或未注释的转录本的可能性，这些转录本逃避了微阵列的检测。 尽管如此，它提供了一个有用的工作定义。

使用这些严格的标准，我们在基础无雌激素生长条件下的 MCF-7 细胞中鉴定出了 5,104 个明确“表达”和 3,632 个明确“未表达”基因（参见补充材料中的图S1B）。 正如预期的那样，大多数表达基因在其启动子处含有 Pol Ⅱ（表达 Pol+ ），而大多数未表达基因则缺乏 Pol Ⅱ（未表达 Pol- ）（图 1A ）。 然而，令人惊讶的是，PolⅡ 结合基因的一个子集在测试条件下没有表达（未表达的 Pol+；图 1A ）。 这些发现表明，目标启动子上 Pol Ⅱ 的负载不一定与基因表达或 Pol Ⅱ 活性相关。

2. 未表达基因处预载的 Pol Ⅱ 可以进行转录起始

未表达基因启动子处的 Pol Ⅱ 可能与作为 PIC 一部分的一般转录因子相关。在这种情况下，Pol Ⅱ Rpb1 亚基的 CTD 在七肽重复序列的Ser2 和 Ser5 处应大部分未磷酸化。或者，Pol Ⅱ 可能在启动后/延伸阶段的早期暂停于启动子近端，无法进展到有效延伸状态。在这种情况下，Pol Ⅱ Rpb1 亚基的 CTD 应优先在Ser5 位点磷酸化，而不是在 Ser2 位点磷酸化 （图 1C）。 

为了探索这两种与我们的 Pol Ⅱ 启动子结合结果相关的可能性，我们使用特异性识别 Pol Ⅱ CTD 的 Ser5 磷酸化(Ser5P) 形式的抗体进行了 ChIP-chip （图 1B）。 正如预期的那样，Ser5P 在与 Pol Ⅱ 结合一致的表达基因的 TSS 处达到峰值（Pol+），而在未表达的 Pol 基因的 TSS 处检测到很少的Ser5P（图 1B，顶部和中间）。 未表达的 Pol+（即“预加载”）基因启动子处的 Ser5P 状态可用于将基因分为两个不同的组——大约三分之二的基因在启动子处显示很少的 Ser5P（Ser5P；可能代表 PIC 结合启动子），而其余基因在 TSS 处显示 Ser5P 峰值（Ser5P；可能代表 Pol Ⅱ 在早期延伸阶段暂停） （图1D）。 这些结果表明，未表达基因启动子上预加载的 Pol Ⅱ 可能处于转录前启动阶段或早期延伸阶段。与这一观察结果一致，基因特异性 ChIP 分析揭示了未表达的 Pol+ Ser5P- 和未表达的 Pol+ Ser5P+ 基因的 TSS 处存在Pol Ⅱ和 TFⅡB，但不存在于下游1 kb 区域（图 1E ）。

3. 大多数雌激素调控的启动子在 E2 处理之前加载有 Pol Ⅱ

尽管目前的模型表明预载 Pol Ⅱ 的招募后激活在信号调节基因表达中发挥作用，但尚未在基因组上研究特定细胞信号在招募后调节 Pol Ⅱ 活性的程度。 为了在高等真核生物中探索这一点，我们研究了雌激素（一种发育和生理上重要的信号分子）调节 Pol Ⅱ 占据和目标启动子活性的机制。 首先，我们通过对经过或未经 3 小时 E2 处理的 MCF-7 细胞进行表达微阵列分析，确定了雌激素信号传导的靶基因。 该分析揭示了560 个基因的表达在 E2 处理后发生了显著变化； 291 种受到刺激，269 种受到抑制，这一发现与之前的报道一致（图 2A）。

接下来，为了确定这些 E2 调节基因的启动子上的 Pol Ⅱ 占据情况，我们在经过或不经过 45 分钟 E2 处理的 MCF-7 细胞中对 Pol Ⅱ 进行了ChIP-chip（图 2B）。 我们使用了简短的 E2 处理，以便于检测直接效应，而不是次要效应。 令人惊讶的是，与以往认知的 E2 配体 ER 激活基因的“Pol Ⅱ 募集”模型相反，大多数（291 个中的 171 个 [59%]）E2 刺激基因在E2 处理前其启动子的Pol Ⅱ 水平升高（包括两个研究最深入的哺乳动物“暂停的 Pol Ⅱ”基因，MYC 和FOS ；图 2B，顶部）。 在 E2 处理后，这些水平要么增加（即 Pol Ⅱ 预结合并进一步招募），要么保持不变（即 Pol Ⅱ 预结合并保持不变）（统称为“Pol Ⅱ 预加载”基因）（图 2C 和 D）。 对于 E2抑制基因组也观察到类似的趋势，其中大多数在 E2 处理之前和之后都含有 Pol Ⅱ（图 2B 底部和 C）。 我们将剩余的研究重点放在调节 E2 依赖性基因激活的机制上，这些机制比 E2 依赖性基因抑制更容易理解。 在 E2 处理之前，通过对所选靶基因进行核 run-on 分析证实了 Pol Ⅱ 预加载基因的启动子上存在 Pol Ⅱ（参见补充材料中的图 S4）。

我们的基因表达和 Pol Ⅱ ChIP-chip 结果表明，对于大多数 E2 调节的基因，Pol Ⅱ 在启动子占据的变化不足以解释 E2 处理后基因表达的变化。 在这方面，所有“组成型”Pol Ⅱ 预加载基因（总共 171 个中的 126 个）在 E2 处理后表现出表达显著增加，而其启动子处的 Pol Ⅱ 占用率没有显著增加（图 2D）。 我们目前的研究使用包含所有 RefSeq 启动子的微阵列平台，对包含预装载 Pol Ⅱ 的 E2 调控启动子的百分比提供了比我们之前的研究更高的估计 (24)， 这可能是由于我们之前的研究中使用了较小、有偏向的微阵列平台。

4. 在 E2 刺激的情况下，预载的 Pol Ⅱ 会移动到基因体内

在 E2 刺激之前，E2 响应基因的启动子上存在预加载的 Pol Ⅱ，这表明 E2 信号在招募后调节 Pol Ⅱ 的活性中发挥作用。 例如，E2 可以通过促进 Pol Ⅱ 转录延伸到基因体内。 为了测试这一点，我们针对 ChIP-chip 研究中发现的所有 E2 刺激的 Pol Ⅱ 预载基因，将 TSS 处的 Pol Ⅱ 占用率与下游区域的 Pol Ⅱ 占用率进行了比较（有或没有 E2 刺激）。 在 E2处理之前，下游 Pol Ⅱ 占用率显著低于TSS 处的占用率(P=2 × 10e7 )（图 3A，左）。 E2 处理后，下游的 Pol Ⅱ 占用率增加至与TSS 处观察到的相似水平（图 3A，右），表明 E2 处理促进预载 Pol Ⅱ 通过基因的移动。 为了验证这些结果，我们通过 ChIP-qPCR 分析了 ChIP-chip 实验中鉴定的 12 个 E2 刺激基因的 TSS 和下游1-kb区域中 Pol Ⅱ 的占据情况（图 3B 和 C，数据未显示）。 这些实验证实了 ChIP-chip 的结果，并表明E2 刺激的基因可以根据其启动子上 Pol Ⅱ 结合的调节分为两大类：(i) Pol Ⅱ 预加载型基因 (n = 171)，其中 Pol Ⅱ 是 在 E2 处理之前主要存在于 TSS，并在 E2 处理后进入基因体内（例如 CYP1B1、MYC、CEBPB、SIAH2、PMAIP1、FOS、MDM2 和 STC2；图 3B 和未显示的数据）；  (ii) Pol Ⅱ 招募型基因 (n = 42)，其中 Pol Ⅱ 在 E2 处理之前不存在，并在激活后被募集（例如，TFF1、GREB1、KRT13 和 HOXC5；图 3C 和数据未显示）。 我们的 ChIP-chip 和基因特异性研究表明，在大多数情况下，E2 通过调节 Pol Ⅱ 的活性而不是招募来控制靶基因表达。

5. E2 刺激预载 Pol Ⅱ 的磷酸化

为了探索 E2 信号传导调节 Pol Ⅱ 活性的机制，我们通过 ChIP-qPCR 确定了 E2 对 E2 靶基因上 Pol Ⅱ CTD 磷酸化的影响。 在 E2 处理之前，TSS 处预载的 Pol Ⅱ 在Ser5 处被磷酸化，但 Ser2 几乎没有磷酸化（图 4A 和 B）。E2处理后，PolⅡ预加载和Pol Ⅱ募集基因的TSS和下游区域的Ser5P和Ser2P增加，表明Ser5/Ser2磷酸化的Pol Ⅱ通过该基因的移动（图4A和B）。 这些结果与我们之前的研究结果一致 (24)，并对其进行了扩展，表明在 E2 处理之前，预加载的 Pol Ⅱ 可能会启动转录，但无法进入生产性延伸。 此外，他们认为 E2 诱导的 Pol Ⅱ 磷酸化（主要是 Ser2P）是刺激预载 Pol Ⅱ 延伸活性的触发器。

为了进一步研究 E2 如何刺激 Pol Ⅱ 的磷酸化和延伸活性，我们分析了 Cdk9 在 E2 刺激基因的 TSS 和 +1-kb 区域的定位。Cdk9是 P-TEFb 的一个亚基，是主要负责 Pol Ⅱ CTD 中 Ser2 磷酸化以及生产性延伸的激酶 。 有趣的是，Cdk9 以 E2 依赖性方式被招募到 E2 刺激的基因中，对于大多数基因，Cdk9 在+1-kb区域的占据率较高，这一发现与其与 Pol Ⅱ 一起通过基因移动的能力一致 (图4C)。 在这方面，DRB 对 Pol Ⅱ 激酶（例如 Cdk9）活性的抑制阻断了代表性 Pol Ⅱ 预加载和 Pol Ⅱ 募集基因的 E2 依赖性诱导 （例如 CYP1B1 和 TFF1；参见补充材料中的图 S5）。 总的来说，我们的研究结果提供了将 E2 信号传导与 Cdk9 招募、Pol Ⅱ CTD 磷酸化和 E2 刺激基因的转录激活联系起来的证据。

6. NELF 与 Pol Ⅱ 预载启动子结合并在 E2 刺激之前抑制基因表达

除了调节 E2 诱导的 Pol Ⅱ 激活的机制之外，我们还研究了在 E2 处理之前阻止预加载的 Pol Ⅱ 通过基因体转录的机制。 NELF 和 DSIF 复合体是两个共调节因子，它们合作抑制转录延伸并在启动子处建立暂停的 Pol Ⅱ 。 因此，我们研究了 NELF 和 DSIF 在 E2 调节启动子处预载 Pol Ⅱ 的调节中的潜在作用。 我们在用 ChIP-chip 进行 E2 处理之前测定了 NELF-A 亚基与 E2 刺激的启动子的结合，如上面针对 Pol Ⅱ 的描述一样。 有趣的是，我们观察到NELF-A 与预加载 Pol Ⅱ 的大多数启动子结合，但很少有 NELF-A 与招募的 Pol Ⅱ 启动子结合（图 5A），这一发现与我们之前的研究一致（24）。 基因特异性 ChIP 测定证实了这些结果，并揭示了DSIF 的 Spt5 亚基的类似结合模式（图 5B，参见补充材料中的图 S6）。 E2处理后，NELF-A和Spt5仍然与这些基因的启动子相关，尽管E2依赖性Cdk9募集和Pol Ⅱ磷酸化（图4）足以克服NELF和DSIF的负面影响并允许Pol Ⅱ 通过基因转录。 总之，我们的结果表明，在Pol Ⅱ 磷酸化和 E2信号激活之前，NELF 和 DSIF 参与了 E2 刺激基因启动子处预载 Pol Ⅱ 的负调节。 他们还表明，NELF 和 DSIF 虽然仍与启动子相关，但在 E2 刺激后无法消除其负面影响。

为了进一步了解 NELF 在 E2 依赖性 Pol Ⅱ 激活中的作用，我们在MCF-7 细胞中敲低了 NELF-B，这是一种已被证明与 ER 相互作用的 NELF 亚基。 有趣的是，NELF-B 的敲低也导致 NELF-A 和 NELF-E 蛋白水平降低，这可能是由于整个 NELF 复合物的不稳定所致（图 5C）。 为了研究 NELF 消耗对 E2 调节基因表达的影响，我们测定了经过或不经过 3 小时 E2 处理的几个 Pol Ⅱ 募集和Pol Ⅱ 预载基因的mRNA 水平（图 5D 和 E）。 NELF耗尽对Pol Ⅱ招募基因的基础转录或E2反应没有重大影响（图5D），但确实增加了Pol Ⅱ预载基因的基础基因表达水平，这一发现与NELF 防止预加载的 Pol Ⅱ 在 E2 处理之前转录基因一致（图 5E）。 有趣的是，NELF 耗尽对 E2 刺激后的基因表达没有重大影响，证实了我们的假设，即 NELF 尽管存在，但在 E2 依赖性 Pol Ⅱ 磷酸化和Cdk9 招募后无法继续维持其负面影响（图 5F）。

7. Pol Ⅱ 预载基因比 Pol Ⅱ 招募基因更容易受到 E2 的刺激

目前的假设表明，预载 Pol Ⅱ 的招募后激活在响应生理和环境信号的基因快速诱导中具有重要的生物学作用。 在这方面，我们发现Pol Ⅱ招募和Pol Ⅱ预载基因在不同的基因功能类别中富集（图6）。 例如，Pol Ⅱ 预载的基因在可能期望快速诱导的功能类别中富集（例如，细胞周期调节和应激反应），而 Pol Ⅱ 招募的基因在其他功能类别（例如，发育）中富集。

为了进一步探讨这一点，我们检查了 Pol Ⅱ 预加载基因和 Pol Ⅱ 招募基因之间E2 依赖性诱导动力学是否存在差异。MCF-7细胞用E2处理0、1、3和6小时，并通过定量RT-PCR测量许多E2刺激基因的mRNA水平（图7A和B）。 平均而言，E2 刺激 Pol Ⅱ 预载基因的速度明显快于 Pol Ⅱ 招募基因的刺激速度（P = 0.001），前者在 E2处理后 1 小时达到峰值，后者在 E2 处理后 3 小时达到峰值（图 7C）。 与这些基因表达结果一致，与招募到 TFF1 基因的 Pol Ⅱ 相比，预加载的Pol Ⅱ 更快地移动到 CYP1B1 基因体内（参见补充材料中的图 S7）。 尽管Pol Ⅱ预加载和募集后激活与更快速的转录反应相关，但处理3小时后的绝对 E2 诱导在PolⅡ预加载和Pol Ⅱ募集基因之间没有差异（图7D）。 有趣的是，我们检查的许多 Pol Ⅱ 预载基因在增强（例如 MYC、CEBPB 和 SIAH2）或减弱（例如 CYP1B1 和 MDM2）E2 信号传播方面发挥着重要作用（参见讨论）（图 7E）。 总而言之，我们的结果表明，在招募后水平上细胞信号对 Pol Ⅱ 的调节可能会促进即时反应，从而有助于细致地进行信号反应调节。

讨论

在这项研究中，我们使用基因组和基因特异性检测来检查 Pol Ⅱ 在基础生长条件下整个基因组启动子的结合和调节，以及对 E2 信号传导的反应。 我们的结果表明：（i）Ser5 磷酸化的Pol Ⅱ 广泛分布在许多未表达基因的启动子上，在 E2 信号传导之前，（ii）E2 信号传导的主要基因组结果是通过磷酸化对 Pol Ⅱ 活性进行招募后调节，(iii) NELF 通过预载Pol Ⅱ 抑制转录延伸，直至接收到 E2 信号，并且 (iv) 预载 Pol Ⅱ 的 E2 依赖性激活促进快速基因调控反应，这在调节雌激素信号传导本身中发挥重要的生理作用。 这些研究超出了我们之前的工作 (24)，我们之前的工作使用了有限数量的启动子 (~1,000) 的较小的微阵列平台，包括在其他实验室进行的先前研究中鉴定的一组有偏差的 E2 调节基因。 总的来说，我们的结果建立了一种新的 E2 依赖性基因调控模式，该模式可能适用于多种信号调控途径。

许多未表达的基因在其启动子处预载了 Pol Ⅱ。 我们的结果表明，人类基因组中大部分（~20%）未表达基因的启动子在特定信号事件之前已预加载 Pol Ⅱ（图 1C）。 对于这些基因中的约三分之二，预加载的 Pol Ⅱ 保留在 PIC 中，而对于其余基因，预加载的 Pol Ⅱ 已启动转录，如 Ser5P 所示，但无法进行生产性延伸（图 1D）。 我们的结果与其他研究一致表明在特定信号事件之前，Pol Ⅱ 广泛分布在许多未表达基因的启动子处，尽管这些预载 Pol Ⅱ 的Ser5P 状态以前没有研究过。 目前的假设表明，未表达基因上预载的 Pol Ⅱ 在适当的时间被某些生理或发育信号激活。 尽管这一假设已在基因特异性研究中得到检验，但仍需要一种全基因组方法来评估特定信号通路 Pol Ⅱ 招募后激活的普遍性和机制。

雌激素信号通过磷酸化激活预载的 Pol Ⅱ。 目前 E2 和其他信号通路的信号依赖性转录模型重点关注 Pol Ⅱ 向目标启动子的信号依赖性招募。 这种“Pol Ⅱ 募集”模型是基于信号调节基因的有限子集开发的，其通用性尚未在整个 E2 调节转录组中得到检验。 最近的研究以及此处描述的结果表明，在特定信号事件之前，Pol Ⅱ 广泛分布在基因启动子处，但特定的细胞信号激活预载 Pol Ⅱ 此前尚未在全基因组范围内研究过。

在这里，我们显示大多数 E2 刺激的基因 (59%) 预载有 Pol Ⅱ，在 E2 处理之前，Pol Ⅱ 主要保留在 TSS 中，并在 E2 处理后移动到基因体内（图 3）。 Pol Ⅱ 的这种运动与 E2 依赖性 Pol Ⅱ 磷酸化（主要是 Ser2P）以及 Cdk9 招募同时发生（图 4）。 因此，DRB 对 Pol Ⅱ 激酶活性（例如 Cdk9）的抑制消除了 E2 刺激基因的诱导（参见补充材料中的图 S5）。 大多数 E2 刺激基因的编码区中 Cdk9 的占据率较高，这一发现与其与 Pol Ⅱ 一起穿过该基因的能力一致。 总之，我们的结果与 E2 刺激的 Cdk9 募集和 Pol Ⅱ 磷酸化的直接转录作用一致。 但请注意，DRB 也已被证明具有非转录效应（例如，干扰 RNA 加工）。

Cdk9 的 E2 依赖性募集提供了一种通过 E2 信号传导调节 Pol Ⅱ 依赖性转录的新方法。 Cdk9 与细胞周期蛋白 T 结合形成 P-TEFb，它磷酸化 Pol Ⅱ CTD 的Ser2、 DSIF 和 NELF，从而允许暂停的Pol Ⅱ 进入生产性延伸。 一个问题是 E2 处理后 Cdk9 被招募到基因中的机制。 有趣的是，细胞周期蛋白 T 已被证明与 ERα 相互作用，并可能负责将 Cdk9 招募到 E2 刺激的基因 。 另一种机制可能涉及含有溴结构域的蛋白 BRD4，该蛋白通过与乙酰化组蛋白的相互作用介导 P-TEFb 与人类基因的关联 。 总的来说，我们的结果扩展了 E2 信号共调节因子的列表，除了经过充分研究的转录起始因子之外，还包括对转录延伸重要的因子。

NELF 在 E2 刺激之前而不是之后介导其负延伸效应。 我们的研究表明，NELF 和 DSIF 在 E2 处理之前与大多数 Pol Ⅱ 预载启动子结合，但在相同条件下几乎不与招募 Pol Ⅱ 的启动子结合（图 5A 和 B）。 这些结果与 NELF 和 DSIF 在基因 5' 端建立暂停的 Pol Ⅱ 中的作用一致。 但有趣的是，E2 处理后，NELF 和 DSIF 仍与 Pol Ⅱ 预载基因的启动子相关，这表明，虽然启动子释放了 NELF 和 DSIF，但 Pol Ⅱ 的 E2 依赖性激活并未发生。 一种可能性是，E2 依赖性 Pol Ⅱ 磷酸化足以通过使 Pol Ⅱ CTD 易于接触、结合延伸因子来克服 NELF 和 DSIF 的负面影响 。 与这一假设一致，我们的 NELF 敲低研究表明，NELF 在 E2 处理之前抑制 Pol Ⅱ 预载基因的表达，但在 E2 依赖性 Pol Ⅱ 磷酸化和 Cdk9 招募后无法介导其负面影响，即使 NELF 仍然在启动子处（图5E）。 另一种可能性是NELF 通过 Cdk9 磷酸化而失活，如体外所示（17），尽管尚未在体内进行探索。 第三种可能性是 NELF 和 DSIF 与启动子的持续关联是由于与重新启动的 Pol Ⅱ 的重新关联。 在未来的研究中测试这些和其他可能性将会很有趣。

Aiyar 等人之前研究过 NELF 在配体调节的 E2 靶基因激活中的作用，重点关注招募 Pol Ⅱ 的基因（例如 TFF1，也称为 pS2）。 他们发现，在 NELF-B（也称为 COBRA1）耗尽后，TFF1 的基础表达和 E2 诱导的表达都会增加，并得出结论，COBRA1 会导致 Pol Ⅱ 在 TFF1 的启动子近端区域暂停。 这一结果与我们的观察结果明显矛盾，即 NELF-B 耗尽对 TFF1 和其他“Pol Ⅱ 招募”基因的表达没有重大影响。 一种可能的解释是 Aiyar 等人他们使用 T47D 细胞进行实验，而我们使用 MCF-7 细胞。 NELF-B 缺失对 TFF1 表达的影响可能是细胞类型特异性的，不同乳腺癌细胞系中雌激素调节的基因表达模式也是如此 。 有趣的是，T47D细胞中的基础 TFF1 表达远低于 MCF-7 细胞中的基础 TFF1 表达（数据未显示），可能 NELF 和其他负调节复合物可能在 T47D 的 TFF1 调节中比 MCF-7 细胞发挥更大作用。

Pol Ⅱ 的招募后调节可实现快速的基因调节反应和可能的自我调控。 先前的研究表明，预载 Pol Ⅱ 的招募后激活在响应生理和环境信号的基因快速诱导中具有重要的生物学作用 。 我们的动力学分析表明，E2 刺激 Pol Ⅱ 预载基因的速度明显快于 Pol Ⅱ 募集基因（图 7C）。 这些结果基于mRNA 水平的稳态测量，与直接转录效应一致，但也可能包括对 mRNA 稳定性和周转率的影响。 有趣的是，我们在分析中发现的许多 E2 刺激的 Pol Ⅱ 预载基因在调节 E2 信号通路中发挥着重要作用。例如，MYC、CEBPB 和 FOS 基因编码的转录因子与 ERα 配合调节次要靶标，从而传播 E2 信号转导（图 7E）。 此外，编码泛素连接酶的 SIAH2 通过靶向核辅阻遏物 NCoR 并使其被蛋白酶体快速降解，有助于全基因组传播雌激素信号反应。 然而，并非所有快速刺激的 Pol Ⅱ 预载基因都能以积极的方式调节 E2 信号传导。 例如，CYP1B1 编码细胞色素 P450 单加氧酶，可代谢 E2，并且可能是控制靶组织中 E2 水平的快速代谢反馈调节的一部分。 此外，MDM2 编码一种泛素连接酶，参与 E2 处理后蛋白酶体快速降解 ERα。 之前已经针对一系列细胞信号描述了靶基因正向和负向自动调节的类似例子，包括丝裂原激活蛋白激酶、NF-κB、转化生长因子 β 和 STAT 调节途径。 在我们检查的 Pol Ⅱ 招募基因组中，这种自动调节功能并不明显。 总的来说，我们的结果以及之前的研究表明，Pol Ⅱ 作为细胞信号通路终点的 招募后调节可能会促进快速反应，从而有助于细胞信号本身的精确调节。

Kininis M, Isaacs GD, Core LJ, Hah N, Kraus WL. Postrecruitment regulation of RNA polymerase II directs rapid signaling responses at the promoters of estrogen target genes. Mol Cell Biol. 2009 Mar;29(5):1123-33.