Plant Stress：应用HaloTag pull-down技术鉴定了与胡杨CPK21互作的重金属胁迫相关蛋白

镉(Cd)污染因其毒性在全球范围内造成了严重的生态问题，重金属对植物造成的伤害除了离子毒害效应，还会影响植物的水分状况，造成植物生理干旱。当前，干旱也已成为全球农林业生产和发展的重大威胁。

胡杨（Populus euphratica）是广泛分布于我国西北干旱、盐碱地区的一种高大乔木，具有很强的抗旱耐盐能力，并且能够吸收和积累重金属，是研究树木抗逆生理和分子机制的重要模式树种。

钙(Ca2+)是植物感知生物和非生物胁迫的典型信号分子，Ca2+信号和cpk对广泛的环境刺激做出反应，并协调信号网络和生理反应(Poovaiah等，2013)。然而，Ca2+信号和cpk是否调节植物对重金属的反应很少被研究。

2023年12月19日，北京林业大学陈少良教授课题组研究成果，发表在Plant Stress期刊上（影响因子5.0），文章题目为Populus euphratica CPK21

interacts with heavy metal stress-associated proteins to mediate Cd tolerance in Arabidopsis。

该研究借助HaloTag pull-down技术，富集了PeCPK21相互作用蛋白，Cd处理后相应的表达谱表明，PeCPK21与重金属胁迫相关蛋白(HMAPs)相互作用，介导了转基因拟南芥对Cd的耐受性。

1.Cd处理的胡杨中的PeCPK21表达

PeCPK21的表达在根和叶中不同。叶片中，PeCPK21转录物在CdCl2处理3小时后增加，6小时达到峰值，随后迅速下降，12h后进一步增加。根系中，Cd处理12h后PeCPK21显著增加，24h达到峰值，而后迅速下降。

2.Cd激活拟南芥PeCPK21启动子表达

胡杨PeCPK21启动子构建PeCPK21pro转到拟南芥中。无CdCl2胁迫，根、子叶和下胚轴中GUS信号浓度较低。CdCl2胁迫，根，子叶和下胚轴中的GUS活性增加。结果表明Cd激活PeCPK21，PeCPK21在胡杨根叶表达增加。

2.PeCPK21转基因拟南芥的Cd耐受性

作者选择8个PeCPK21转基因拟南芥品系，确定其在镉胁迫下的作用。RT-qPCR表明，在转基因系中表达高，OE2中表达最高，OE8最低。之后选OE3、OE7和OE10转基因幼苗进行镉实验。CdCl2处理WT、VC和三个转基因系确定镉耐受性的表型差异，结果表明，在CdCl2胁迫下，PeCPK21正调控转基因拟南芥根长、鲜重和膜稳定性。

4.根系中细胞镉的积累和镉通量

Cd荧光探针检测根部细胞Cd含量。用CdCl2处理后，所有根细胞荧光显着增加，转基因拟南芥荧光强度相对较低，对照组几乎无荧光，这表明PeCPK21抑制Cd在拟南芥根积累。NMT监测拟南芥幼苗根尖中Cd通量，对照组中根顶端区域通量低，幼苗中Cd通量高，而转基因系OE3、OE7和OE10的Cd2+通量显著降低。

5.H2O2积累和抗氧化酶活性

Cd积累促进植物细胞产生ROS。用荧光探针H2DCF-DA测定根部细胞H2O2浓度。CdCl2处理后，所有拟南芥荧光强度均显着增加，转基因系中Cd诱导的H2O2增加降低，对照组DCF荧光非常低。检测CAT、APX、POD和SOD的总活性，确定PeCPK21过表达植株在镉胁迫下不产生ROS。CdCl2胁迫下所有品系的APX、POD和CAT活性增加，OE3、OE7和OE10活性最高。但CdCl2抑制SOD的活性，WT、VC和PeCPK21过表达的品系中没有显著差异。

6.拟南芥中PeCPK21相互作用的蛋白

为探究PeCPK21介导Cd和ROS稳态的功能，用HaloTag pull-down技术富集与PeCPK21相互作用蛋白。该实验过程是使用体外真核蛋白表达系统将PeCPK21表达出来，再与胡杨的总蛋白进行Pull down实验，最后将与PeCPK21结合的蛋白进行质谱鉴定。

与PeCPK21相互作用的HaloTag pull-down富集蛋白列中，分为四组：

（I）阳离子/重金属转运蛋白、膜联蛋白、K+–H+交换样蛋白（KHEP）、钙单向转运蛋白、铜转运蛋白5（COPT5）、寡肽转运蛋白3（OPT3）、植物防御素样蛋白2.2（PDF2.2）、PM相关阳离子结合蛋白（PCAP1）和ABC转运蛋白I家族成员6（ABCI6）;

（II）质子泵亚基、V型质子ATP酶亚基a3（VHAa3）、VHA-B1、VHA-C、焦磷酸盐活化膜质子泵2（AVPL1）和V型质子ATP酶蛋白脂质亚基（AVA-P2）;

（III）抗氧化酶，类囊体抗坏血酸过氧化物酶（TAPX），超氧化物歧化酶（MSD1），抗坏血酸过氧化物酶1（APX1），APX2，APX3，硫氧还蛋白M4（TRXM4），9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED1），谷胱甘肽过氧化物酶（GPX3），硫氧还蛋白样蛋白CDSP32和硫氧还蛋白超家族蛋白（PRXQ）;

（IV）膜内源蛋白、质膜内源蛋白1;1（PIP1-1）、PIP2-6、PIP2-7、PIP2A和tonoplast内源蛋白。

7.PeCPK21相互作用蛋白的转录本分析

7.1阳离子/重金属转运蛋白的转录

通过钙渗透通道介导Cd进入的膜联蛋白的转录被CdCl2上调，在PeCPK21-OE3、7、10中低于WT和VC。CdCl2增加拟南芥中钙单向转运体、KHEP、COPT5、OPT3和PDF2.2的表达，但在PeCPK21过表达系中观察到更高的水平。然而，用CdCl2处理所有样品中PCAP1和ABCI6的转录并未显着改变。

7.2质子泵亚基的转录

CdCl2处理增加了所有测试品系中VHA-B1、VHA-C、AVPL1和AVA-P2的表达。与WT和VC相比，VHAB1、VHA-C和AVA-P2的Cd诱导在PeCPK21过表达的品系中更为明显。然而，在所有测试品系中，VHA-a3的转录均未改变。

7.3抗氧化酶的转录

所有测试品系证明CdCl2上调PeCPK21相互作用的几种抗氧化酶的表达。与WT和VC相比，这些抗氧化酶TAPX、APX1、APX2、TRXM4、NCED1、GPX3、CDSP32、PRXQ在PeCPK21-OE3、7、10中表达量高。

7.4膜内源蛋白的转录

CdCl2胁迫后，PIP1-1、PIP2A和PIP2-7的转录水平增加，与WT和VC相比，PeCPK21过表达植物的水平更高。CdCl2处理不影响PIP2-6和TIP1的转录。

小结：

综上所述，Cd通过激活PeCPK21启动子上调胡杨PeCPK21的转录。钙传感器PeCPK21可以提高植物对Cd胁迫的耐受能力，表现为过表达PeCPK21的拟南芥的根和全株生长减少较少。HaloTag pull-down富集蛋白和相应的表达谱表明，PeCPK21通过与多种重金属胁迫相关蛋白相互作用，限制Cd积累，增加ROS清除，改善转基因拟南芥的水分状况，从而提高Cd耐受性。

HaloTag Pull down技术简介

体外蛋白表达与Pull down技术相结合，表达出目的蛋白和标签蛋白（Halo，GST，His等）的融合蛋白，不受抗体和物种限制，仅借助标签的亲和介质将目标蛋白纯化出来，使用Pull down技术，将目标蛋白与互作的蛋白“下拉”，进而利用Western Blot或者质谱鉴定互作蛋白。蛋白Pull down实验还可以同时表达两个蛋白，进行点对点的互作验证，也可以仅表达蛋白质的结合区域，确定两个蛋白结合的结构域。

Halo/FLAG-tag pull down是使用基于真核的体外表达系统来表达目的蛋白，目的蛋白携带Halo/FLAG标签；GST-tag pull down是使用基于原核的体外蛋白表达系统，或者大肠杆菌诱导表达目的蛋白，目的蛋白携带GST或His标签。

Halo/FLAG-tag pull down技术优势：

真核表达系统，蛋白更接近体内结构

没有细胞内干扰因素的限制，表达成功率高

蛋白表达载体构建成功后，不需要转化和鉴定，可直接表达目的蛋白，节省时间