原代培养和传代培养

原代培养

原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，也是一项基本技术。在原代培养中，将动物机体的各种组织取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，在合适的培养基和环境下培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。因此，严格说来是，原代培养是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，我们通常把第一代至第十代以内的细胞培养统称为原代细胞培养。

最常用的原代培养有组织块培养、消化培养法、分散细胞培养和器官培养法。

① 组织块培养法

组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。

　② 消化培养法

此法进行原代细胞培养时，首先需要将组织样本取出，去除其中血管和结缔组织，然后将其切成小块。接着将组织块放入酶消化液中，进行消化。消化时间的长短取决于组织的种类和大小，一般需要在37℃下进行1-2小时。消化结束后，将消化液离心，去除上清液，留下细胞沉淀。细胞沉淀可以用细胞培养基进行洗涤，去除残留的酶消化液和细胞碎片。最后将细胞沉淀转移到培养皿中，加入适量的细胞培养基，放入培养箱中进行培养

　③ 悬浮细胞培养法

对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。

　④器官培养

器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。

传代培养

体外培养的原代细胞或细胞系要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，此即为传代培养。

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

依据细胞生长的特点，传代方法有3种：

①悬浮生长细胞传代（离心法）

将悬浮细胞离心（1000 rpm， 3 min）去上清，收集沉淀物加新培养基，混匀后进行传代培养。

②半悬浮生长细胞传代（直接吹打法）

此类细胞（如Hela细胞）部分贴壁，但黏贴不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁上脱落下来，进行传代。

③ 贴壁生长细胞传代（酶消化法）

去除培养容器内培养液后，加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液（以消化液覆盖整个瓶底为准）37℃静置2-10min（显微镜下动态监测）。移去蛋白酶液，加入培养液反复吹打瓶壁细胞，离心将细胞沉淀用培养液制成细胞悬液。吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于含有适量新鲜培养液的新培养瓶中进行传代培养。