RNA 的提取

RNA很容易降解，为单链结构，应全程无RNase环境中操作，并佩戴好口罩、手套

RNA提取的常用方法

基本原理：使用单相裂解试剂进行RNA提取，该方法中，生物样品被异硫氰酸胍和苯酚的单相溶液所破坏而裂解，然后加入氯仿（或溴氯丙烷），混匀后离心，匀浆被分离成水相和有机相，RNA仅存在于上层水相，而DNA处于水相和有机相的分界处，变性蛋白存在于下层有机相。

回收水相后，通过加入异丙醇沉淀RNA。

如果需要提取DNA和蛋白质，可以通过顺序沉淀分离：中间相用乙醇沉淀得到DNA，从有机相中用异丙醇沉淀获得蛋白质；

从中间相回收的DNA为20kb大小，可用做PCR的模板；然而由于暴露于胍盐，蛋白质是变性的，因此主要用于免疫印迹。

实验操作

样本处理：

A. 组织样本

1.将新鲜组织用液氮速冻，迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显可见颗粒)。

研磨不彻底会影响RNA的得率和质量。

2. 将研磨成粉的样品转移至离心管中，大约每50 mg组织加入1mL TRIzol （500μL FreeZol Reagent）, 涡旋振荡至充分裂解，室温静置5 min。

免除氯仿的RNA提取试剂，这里以Vazyme公司的FreeZol Reagent为例（后文简称“FreeZol法”）。

每500μL FreeZol Reagent最多可裂解50 mg动物/植物组织，过多的样本量可能会导致裂解不充分，并使产物纯度降低。肝脏、脾脏、肾脏等组织DNA/RNA含量丰富，过多样本量还会导致gDNA残留或产量降低。

若没有条件用液氮研磨，可将新鲜组织尽量剪碎浸泡在单相裂解试剂中，用电动匀浆器高速匀浆至组织块彻底裂解（这里我使用手动研杵研碎，手动研磨时应注意避免局部积热，尽量在冰上进行）。

3. (可选)11,200 rpm(12,000 x g)室温离心5 min。小心吸取上清至新的1.5 ml离心管，切勿吸取沉淀。

若样本含有较多蛋白质、脂肪、多糖或肌纤维、植物块茎等，可离心去除不溶物质，离心得到的沉淀包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清中。提取脂肪含量较高的组织样本时，若上层含有大量油脂，应去除。转移上清进行后续操作。

B. 悬浮细胞样本

1.离心收集细胞，弃尽上清，每1×105~1×107个细胞加入1mL TRIzol （500μL FreeZol Reagent）。

2.涡旋振荡或用移液器反复吹打直至充分裂解，室温静置5 min。

对于冻存细胞，加入FreeZol Reagent应立即进行振荡,否则会导致裂解不充分。

C. 贴壁细胞样本

1.弃去细胞培养液，用1×PBS清洗一次，弃尽废液。

2.常规6孔板每孔或直径3.5 cm平皿(约10 cm2培养面积)的细胞加入500μL FreeZol Reagent,每100mm平皿加入1mL TRIzol，使之充分覆盖到细胞表面，然后用移液器反复吹打细胞使其脱落。

对于贴壁牢固的细胞(细胞团)可采用细胞刮或者洁净的枪头剥离，或增加单相裂解试剂的用量，亦可在加入单相裂解试剂之前采用胰酶将细胞消化下来，然后按照悬浮细胞处理。

3.将裂解液转移至1.5 ml离心管，涡旋振荡或用移液器反复吹打直至充分裂解，室温静置5 min。

浸在TRIzol试剂中的样本可以在-60~-80°C存放至少一个月