Biparatopic 抗体学习

一直想找一篇纯抗体工程的文章仔细的学习一下抗体发现的过程，这篇2020年的《通过鸡免疫和酵母展示筛选技术快速产生双表位共同轻链抗体》完全满足了我的要求。找到一篇代表性文献，所有不懂的方法都标记上超链接，边看边查，自我感觉是快速学习入门一个领域好方法。

双特异性(Bispecific BsAb) 和双表位(bioparatopic BpAb) 抗体因其具特殊的性质和功能，逐渐成为有潜力的抗体形式。过去几年，鸡源抗体由于其表位覆盖广、文库构建方便等特性，在诊断和治疗领域受到人们的关注。这篇文章报告一种使用酵母展示和表位 binning 筛选方法，快算产生 biparatopic 共同轻链鸡源抗体的技术。由此产生的针对EGFR II 或 III 结构域的单特异性抗体，具有比纳摩尔低 2 到 1 个数量级的亲和力。通过使用 KIH 技术，产生的亚纳摩尔级亲和力的 biparatopic 抗体可以促进与细胞结合、可溶性 EGFR 的聚集，与亲本抗体相比，显示出 ADCC 增强作用。这种通过免疫鸡产生共同轻链biparatopic 抗体的策略，会促进治疗抗体的发展。

1 介绍

与 mAbs 相比，BsAbs 可以同时结合不同细胞上距离较远的抗原，拉近效应细胞和目标细胞间的距离，促进免疫效应。此外，同时靶向于恶性肿瘤细胞表面的肿瘤特异性抗原和免疫检查点抑制剂，可以提高肿瘤特异性效应，并提升双抗的安全性。作为 BsAbs 的一个亚类，BpAbs 可以结合相同抗原上的两个不同表位。Li 和同事发明了一种 biparatopic anti-HER2 的ADC，这种分子可以促进 receptor 的聚集、内吞以及溶酶体的运输（trafficking ），最终导致肿瘤的缩小。Wang 最近发表了一个 anti-CD3 Fab的 C 端融合两种针对不同 HER2 表位的骆驼源 VHHs 抗体。这其实是一个三价抗体，能同时结合 CD3 和 HER2, 依赖 T 细胞介导的细胞毒性杀伤肿瘤细胞，即使在 HER2 低表达的细胞中，也有很好的效果。尽管这种抗体形式提升了毒性效应，它们在体内的使用也受到半衰期的限制。

双抗需要两个臂结合不同的抗原，重链的正确结合需要将两个异质性的链连接在一起，目前 Knob-into-hole，SEEDbodies 和一些依赖静电相互作用的平台方法可以实现这个目的。但是重链正确配对之后，重链和轻链正确配对还是只有1/4的概率，如Fig1A 所示。一些Cross-mab 或者 Fab 界面正交的方法可以解决重链-轻链正确配对的问题，但是共同轻链的方案仍然是最直接最简单的方法，如Fig1B所示。与抗原的结合主要由 VH 区域介导，共同轻链更多是提供稳定性而不是与抗原结合。很明显，共同轻链这种技术需要筛选出只有重链就可以结合的 binders , 并不依赖轻链实现结合。

目前，共同轻链抗体已经在很多双抗上实现了应用。但它们主要集中在一些特殊的 formats 上，如 scFvs 和 VHHs，而 IgG-like 类似的结构却没有。

在过去几十年，广泛用于产生抗体的免疫动物包括，小鼠、大鼠和兔子。但是，在很多情况下用于免疫的一些人源目标蛋白与免疫宿主的一些蛋白同源物具有很高的相似度，这样免疫反应不会很理想。在这种情况下，由于宿主由于没有把这些表位当做异物，产生的抗体表位的覆盖范围也会受限。根据与人类的进化关系，鸡类免疫可以产生针对不同表位更保守、范围更广的抗体。此外，由于禽类基因具有基因转换机制，文库构建会更快速、更容易。由于在鸡类抗体VH、VL区域的N端和C端都不会发生序列变异，这样更有利于使用非兼并引物进行PCR扩增。最近，文章建立了FACS 分选和酵母展示(YSD)的一套技术，用于筛选高亲和力的鸡源抗体。在本篇研究中，详细描述了分离和构建第一个针对 EGFR-ECD(extracellular domain) biparatopic 共同轻链抗体，它通过鸡免疫、表位binning-based 筛选策略和KIH技术组合的方法实现，如 Fig1CD 所示。

2 材料和方法

质粒

pYD1 载体被用于进行酵母展示，或者使用色氨酸缺陷标志物、氨苄抗性、aga2信号肽、VH-CH1 编码序列、aga2 基因 的组合，或者使用亮氨酸缺陷标志物、卡纳抗性、αMFpp8信号肽、VL-CL编码序列的组合。使用半乳糖诱导的启动子控制基因的表达。为了表达全长嵌合抗体，pTT5 载体被用于编码轻链或者重链的恒定区。使用 pTT5 载体表达编码 CH3 段含有 knob 或者 hole 的变异的恒定区，并使用 His 或者 Twin-StrepII Tag 标记。

酵母菌株、文库和Sorting过程

酵母菌株、处理过程以及文库构建按照之前描述的方法。筛选使用 BD Influx FACS Cell sorter 仪器。为了检测表面展示的嵌合Fabs，一个 anti-Kappa AF647 抗体被使用。EGFR-ECD-Fc 嵌合被作为抗原。anti-human IgG Fc-PE 连接子抗体被用于结合Fc段。对于表位 binning-based 筛选步骤，一个EGFR-ECDR 单体分子和嵌合全长 anti-EGFR 单抗（FEB4）被使用。下图是酵母展示的原理图。

使用酵母展示进行 Epitope Binning 和 Mappping

Epitope Binning：诱导的酵母细胞在表面展示FEB4或者SEB7，使用 100nM 的EGFR-ECD进行孵育，使用matuzumab，cetuximab 或者 PBS-B进行封闭。抗体结合使用anti-human IgG Fc-PE 连接子抗体进行验证。
Epitope Mapping：EGFR 的ECD区域被切成包含一些区域的残基，包括1-124,1-176,1-294,273-621,294-543,475-621，使用pCT载体在酵母表面进行展示。表面展示使用 anti-c-myc 抗体进行验证。然后，使用200nM 的 FEB4 或者 SEB7 进行孵育，然后使用anti-human IgG Fc-PE 连接子抗体进行验证。

使用生物膜干涉法（BLI）进行亲和力确定、Epitope Binning、Mixed-Sited-Binding

抗体亲和力测定：anti-human IgG Fc Capture 传感其被 pH 7.4的PBS液体覆盖10分钟，然后将目标抗体铺成薄层，然后加入不同浓度的 EGFR-ECD ，使用动力学 buffer 作为阴性对照。使用 SG 滤波法和 Langmuir 结合模型进行结合动力学计算。
Epitope binning：中将 EGFR-ECD 进行固定，首先添加 400nM 的第一抗体，然后添加相同或者不同表位的第二抗体。如果膜的厚度增加，表明是 epitope 不重合的抗体。
Mixed-Sited-Binding：为了确定是 clean 或者 mixed-site 类型的结合，biparatopic 分子被生物素化，并被固定。然后，加入 250nM 的 EGFR-ECD 或者 buffer。随后加入没有改动的 biparatopic 抗体。如果膜的厚度增加，表明是一个 mixed-site 抗体。

3 结果

VH 结构域正交表位的确定

1、为了获得 anti-EGFR 的共同轻链抗体，使用 EGFR-ECD 免疫鸡，扩增VH基因的编码区，并转移到酵母表达载体pYD1中。随后，VH 库与共同轻链 H2 进行配对。H2 是一种针对人绒毛膜促性腺激素hcG的鸡抗体，选择该轻链是因为它与各种重链配对时具有良好的物理化学性质，包括高稳定性和低聚集性。
2、为了保证富集高亲和力的抗体，使用高浓度至低浓度梯度的EGFR抗原进行 3 轮 FACS 筛选，获得 5*10 单克隆文库，如图SFig1A，X轴是与目标抗体结合的荧光筛选，Y轴是酵母展示的荧光筛选。筛选的单克隆文库使用流式进行分析，显示只有FEB4具有较高的荧光强度，如图SFig1B。在酵母细胞表面进行目标抗原滴定，显示在较低分子浓度下也具有较强的结合强度，如图SFig1C。获得的VH序列与IgG1重组成嵌合抗体，如图SFig1D。随后 FEB4 转移到细胞系内表达，并使用蛋白A进行纯化。
3、为了筛选到针对 EGFR-ECD 的 biparatopic 抗体，除了 FEB4 外，需要筛选到另一个 VH 结构域。
这一步使用 epitope binning-based 的筛选策略：(1)酵母文库使用目标蛋白 EGFR-ECD 进行孵育;(2)添加FEB4；(3)添加荧光标记的 anti-human Fc 抗体，如图Fig1E 所示。

4、只有不同的表位被识别，才意味着筛选到目标抗体，如图SFig2A。通过不同浓度的 EGFR 筛选以及添加 FEB4 筛选，最终只有2.45%的阳性酵母展示细胞被筛选得到，如图SFig2B。为了得到更高亲和力的binders，这些细胞群进行下一步的分选。使用 binning-based staining 进行下一步的随机筛选，最终发现SEB7 具有最强的结合信号，如图SFig2C。获得的序列与IgG1重组成嵌合抗体，如图SFig2D。随后 SEB7 转移到细胞系内表达，并使用蛋白A进行纯化。

轻链效应对结合性质的影响

1、为了研究共同轻链对结合的影响，使用 H1 和 H3 作为 VL 的结构域，它们分别能与FEB4 和 SEB7 的 VH 结构域结合，但与 H2 在 CDR 的长度和氨基酸序列组成上有差异，如图SFig3A。
2、酵母展示抗体使用100,10,1nM 不同浓度的EGFR-Fc 进行染色，FEB4 显示使用不同的轻链具有相同的亲和力，SEB7 显示只有在与 H2 轻链进行配对时，才具有较好的亲和力，如图SFig3B。这说明 FEB4 中轻链结构域只起到稳定 Fab 结构的功能，但在 SEB7 中 H2 共同轻链能调节促进与 EGFR 的结合。

Epitope Binning 和 Epitope Mapping

1、使用以 YSD 方法为基础的 epitope binning（三明治夹心法），确定 FEB4 和 SEB7 的表位。FEB4 与 matuzumab 有竞争，但是不影响EGFR和 cetuximab 的结合。SEB7 不影响EGFR和 cetuximab、matuzumab的结合，如图 SFig4。

2、以BLI（biolayer interferometry）为基础的epitope binning 方法与 YSD 方法的结果一致。FEB4 与 matuzumab 的表位有重合，但是与cetuximab 没有重合。SEB7 的表位既不与 cetuximab 重合，也不与 matuzumab 重合。而且 FEB4 和 SEB7 是正交表位。如图 Fig2。

3、为了研究 FEB4 和 SEB7 具体的结合结构域，对EGFR的胞外区域进行截取，使用YSD和流式分析方法进行具体结合结构域的确定。显示FEB4 和 EGFR 的273-621、294-543片段有结合，这段区域定位到EGFR的 domain III 区域。SEB7 显示与 EGFR 的1-297区域及边缘有结合。如图Fig3AB。
4、为了研究FEB4 和 SEB7 结合的是线性表位还是构象表位，使用YSD方法测试了 EGFR 1-297、294-543区域在 80和4摄氏度下与抗体的结合。显示在温度较高时，FEB4 和 SEB7 与EGFR domain区域的结合较差，说明抗体结合的是构象特异性表位。如图Fig3C。

Biparatopic 抗体的构建

1、为了保证重链异源二聚体化，使用了KIH技术。FEB4的 VH 结构域与 CH1-Knob-Fc 段的编码区融合，C 端添加 Twin-StrepII 标签；SEB7 的 VH 结构域与 CH1-Hole-Fc 段的编码区融合，C 端添加 His 标签。添加 C 端标签是为了特异性的纯化异源 KIH 抗体，而且标签的大小不同，可以直接使用 SDS-PAGE 分离鉴别。
2、Biparatopic 抗体在 Expi294F 细胞系表达的过程中也会产生多种变异体，包括 one-armed(oa) 缺少一个Fab区域的抗体，以及 knob-knob、hole-hole区域的同源二聚体。为了纯化获得正确组装的 bpAbs，首先使用固定化金属亲和力层析(immobilized metal affinity chromatography,IMGT)去除 knob-knob 二聚体，然后使用 Strep-Tactin XT 亲和力层析 进行二次纯化。SDS-PAGE 分析显示获得了正确配对的 BpAb 抗体。如图SFig5。

抗体生物物理学特征

1、使用 BLI 分析亲本抗体 FEB4 和 SEB7 的亲和力，分别为 29.3 和 1.14 nM，单臂变异体具有相似的亲和力、结合率和解离率。FEB4 具有较高的结合率和较高的解离率，SEB7 具有较低结合率和较低的解离率。而 BpAb 具有较高的结合率和较低的解离率，使得与 EGFR-ECD 的亲和力有很大的提升，为637 pM 。 如图SFig6和 Tab1。

2、使用 NanoDSF 测定各抗体的热稳定性，如图SFig7A所示，对330nm的荧光/350nm的荧光一阶求导，波峰对应的是Tm温度，各个抗体的Tm值在65.2-67.8℃之间。完整的抗体结构一般会有2-3个Tm值，分别对应Fab区域，CH2/CH3区域的解折叠。但只有所有结构域都折叠正确抗体才能发挥功能，所以使用最低的Tm值去比较所有抗体的热稳定性。
3、使用 体积排阻色谱SEC 进行聚合体分析，亲本抗体 FEB4 和 SEB7 几乎不存在聚集，KIH 突变体FEB4/SEB7 存在 6.6% 的聚集物，如图SFig7B 和 Table1所示。

表皮生长因子 EGF 竞争实验

1、EGF receptor 与 EGF 结合后会引起EGF receptor 的二聚化，引起下游的信号转导过程。为了验证 FEB4/SEB7 和其亲本抗体对于 EGFR 的干扰结合作用，进行了竞争结合实验。
2、BLI 分析，将抗体加载到AHC biosensor 上，再添加EGFR和不同浓度的 EGF。最终结果显示添加 EGF 抑制了Cetuximab 和 FEB4 抗体的结合；不同浓度的 EGF 对 SEB7抗体与 EGFR 结合几乎没有影响； EGF 也部分抑制了BpAb FEB4/SEB7的结合，如图Fig4A所示。
3、流式分析的结果与 BLI 分析的结果一致，如图Fig4B所示。

聚集检定

1、Biparatopic 抗体可以结合到一个抗原的两个不同表位，Ab 和 Ag 的比例可以是 1:1 的关系（clean site binding）或者是 2:1 的关系（mixed site binding），如图 Fig5A所示。后一种情况，可以引起抗原在目标细胞表面聚集，导致完全不同的生物学效应。接下来的实验研究了 Biparatopic 抗体 FEB4/SEB7 是否促进了 EGFR 分子的聚集。
2、首先是 BLI-based 的方法，生物素化的 FEB4/SEB7 固定在 SAX上，然后添加 EGFR , 然后再用未处理的 FEB4/SEB7 孵育，发现复合物层的厚度增加，表明EGFR可以结合到两种不同的BpAbs上，证明是一种 mixed site binding 关系。如图 Fig5B 所示。
3、ELISA-based 的方法也证明了抗原-抗体结合是一种 mixed site binding 关系。如图Fig5CD所示。

4、使用 SEC 证明了 EGFR 的聚集现象，FEB4/SEB7 和其亲本抗体用 1.2 倍分子数的 EGFR 进行孵育，FEB4/SEB7 有显著的质量偏移，具有更小的保留时间，表明 biparatopic binding 行为引起了更高程度的聚集。如图SFig8所示。

抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用

1、Biparatopic 抗体可以引起对应的 receptors 的聚集，并在目标细胞表面形成一个局部的高聚集的 Fcs 区域。表达 CD16 分子的 NK 细胞会结合在 Fcs 部分，引起 ADCC 效应。
2、使用 NFAT激活荧光素酶 验证 FEB4/SEB7 和其亲本抗体引起的 ADCC 效应，Biparatopic 抗体可以引发更高程度的 ADCC激活。此外，FEB4 相比 SEB7 具有更好 和 更强的ADCC激活。结合Table1中的亲和力数据，说明亲和力和引起ADCC效应的关系是相互独立的。

4 汇总

1、目前临床中的对称或者非对称的 biparatopic 抗体大多都不是 IgG 样的结构，例如两个临床中的 ZW25 和 ZW49 都是由异源的Fc段+Fab+ScFv构成。本文采用 YSD + FACS 筛选获得的 FEB4/SEB7 biparatopic 抗体具有共同的轻链，具有很好的聚集特性、热稳定。而且，采用 epitope-binning based 的方法可以快速筛选出不重叠的 epitopes 抗体。
2、SEB7与EGFR的亲和力比FEB4高30倍，其中FEB4具有更高的解离率。FEB4 和 SEB7 具有不同的亲和力及结合动力学，这也可能是引起 mixed site binding 行为的原因。SEB7 与抗原的表位结合较为紧密，而 FEB4 结合抗原表位之后可以快速解离，并与第二个表位快速结合。相较于持续结合紧密的Fab臂，这种持续的结合和解离模式的 BpAb 可能会引起更强的聚集效应。
3、文章数据显示 BpAb 可以促进与细胞表面的可溶性 EGFR 的交联，并伴随 IgG1 Fc 的聚集，引起更强的 ADCC 效应。
4、尽管获得目标抗体，但是这种 BsAb 是一种嵌合抗体，它的 VL 和 VH 结构域是鸡源的，添加了 IgG1 的 scaffold 。实际应用于临床还要进行人源化改造。

5 参考文献

[1] Bogen J P , Carrara S C , Fiebig D ,et al.Expeditious Generation of Biparatopic Common Light Chain Antibodies via Chicken Immunization and Yeast Display Screening[J].Frontiers in Immunology, 2020, 11.DOI:10.3389/fimmu.2020.606878.