肿瘤免疫与单细胞、空间、外显子和免疫疗法

作者，Evil Genius

2024年了，不得不说真的到了国内老板狂欢的时候了，降本增效声音不绝于耳，如果大家跟我一样，是个不太听话的员工，那可是岌岌可危啊O(∩_∩)O哈哈~。

好了，不管老板们怎么想的，作为个人，还是要好好努力的，今天我们来学习一个更加难的部分，肿瘤与免疫。无论是单细胞、空间、外显子、还包括宏基因组，大部分样本都还是临床肿瘤样本，而肿瘤与免疫几乎是一个永恒的话题，前面提到过，基因过量表达多发生在细胞癌变的起始阶段，基因点突变可能是细胞癌变启动阶段的一个主要事件，这一阶段的可逆性较大；对于基因表达，单细胞技术可以提供很好的帮助，对于突变，就需要借助外显子，对于免疫治疗，就需要空间、VDJ和外显子多组学的内容了。

这一篇我们继续学习基础知识

其实提到的组学里面，最主要的就是肿瘤免疫(tumor immunology)。

机体抗肿瘤免疫应答的机制包括固有免疫和适应性免疫两个方面。

固有免疫应答发挥了第一线抗肿瘤作用，而适应性免疫应答发挥了更为重要的特异性抗肿瘤作用。这两种机制不是孤立存在和单独发挥作用的，而是相互协调来共同杀伤肿瘤细胞。

一、固有免疫应答

(一)固有免疫的概念和功能

固有免疫(innate immunity)是通过种系编码的保守性识别受体，识别病原体或机体自身损伤等所特有的保守性分子模式，产生非特异性免疫防御、监控、自稳等保护作用的过程。固有免疫存在于所有的动植物体内，经遗传获得，是机体在长期种系进化过程中逐渐形成的。固有免疫相关的效应细胞和效应分子也广泛参与了适应性免疫应答的启动和调节过程。
脊椎动物的固有免疫系统主要功能包括:①产生趋化因子和细胞因子等多种化学因子将免疫细胞募集到感染或炎症区域;②识别和清除在血液、淋巴、组织和器官中的外来物质;③激活补体系统来促进死亡细胞或抗原-抗体复合物的清除;④激活适应性免疫系统。

(二)固有免疫细胞对肿瘤的识别与免疫效应

1.巨噬细胞(macrophages,Mφ)在抗肿瘤免疫中不仅作为呈递抗原的抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC),而且也是参与杀伤肿瘤的效应细胞。一般认为，组织中的Mφ主要来源于外周血单核细胞，是由外周血单核细胞迁移进入到组织中并分化而成的组织特异性的 Mφ。但近年的研究提示，组织中的Mφ还可来源于胚胎卵黄囊和骨髓的前体细胞。
Mφ在维持组织免疫平衡、调控适应性免疫应答的强度与持续时间、炎症反应、免疫缓解以及组织修复与重构等方面也发挥着重要作用。Mφ具有很强的可塑性，可根据不同的组织微环境而展现出独特的表型和功能。在体外培养模型中， IFN-y 诱导的Mφ经典活化(classical activation)能够诱导一系列促炎症反应的发生，清除外来病原菌及病变细胞;IL-4和IL-13则诱导了Mφ的非经典活化(alternative activation)，该类Mφ表现为与经典活化完全不同的表型，对于机体抵御寄生虫等引起的疾病具有重要意义。而在体内复杂的环境中，Mφ会根据所处的组织微定位和多种信号的综合调控下，表现出动态的极化特征。
Mφ杀伤肿瘤细胞的机制主要有以下几个方面:①活化的Mφ与肿瘤细胞结合后，通过释放溶细胞酶直接杀伤肿瘤细胞:②活化的Mφ可分泌肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、干扰素(interferon,IFN)及活性氧等多种细胞毒性分子间接杀伤肿瘤细胞:③Mφ与致敏T细胞、特异性抗体和补体协同发挥抗瘤效应;④Mφ通过特异性抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)效应杀伤肿瘤细胞;⑤处理和呈递肿瘤抗原，激活T细胞以产生特异性抗肿瘤细胞免疫应答。尽管活化的Mφ在体外或动物模型中均能有效清除癌细胞,但越来越多的研究指出Mφ在杀伤癌细胞的同时还能通过分泌蛋白酶和生长因子等来促进肿瘤转移、侵袭和血管生成。
2.固有淋巴细胞( innate lymphoid cells, ILC)是一群近年发现的参与固有免疫的异质性淋巴细胞，它们缺少重组激活基因(recombination activating gene,RAG)依赖的抗原特异性受体重排,不表达适应性免疫细胞特有的抗原特异性受体，具有淋巴样细胞形态。ILCs包括NK细胞， ILC1s,ILC2s,ILC3s等亚群，多为组织驻留淋巴细胞,广泛分布于肠道、皮肤等黏膜屏障部位。ILCs能够通过分泌细胞因子等参与抵抗肿瘤的第一道防线。

3、自然杀伤细胞( natural killer cell,NK 细胞)是淋巴细胞的亚群，也可归为ILC，约占外周血淋巴细胞的15%。NK细胞是细胞免疫中的非特异成分，也是机体抗肿瘤的第一道防线，在肿瘤发生早期是起着重要监视作用的效应细胞。
NK细胞虽然不能进行受体的基因重组，但仍具有一些特殊受体，这些受体可以活化或抑制其杀伤和调控功能。NK细胞能够识别和清除缺失MHCI类分子或过表达激活NK细胞表面活化型受体的相应配体分子的非正常细胞。在某些实验模型中,当NK细胞表面同时有多种活化型受体与配体结合，或NK细胞得到足够强的激活信号时,即使靶细胞表面表达MHCI类分子,NK细胞依然能够有效攻击和杀伤靶细胞。可见，NK细胞的活化受到激活与抑制两种信号的平衡调节。此外，研究发现NK细胞还能够表达一系列非MHC分子特异性的抑制型受体,如LAIR-1，MAFA，gp49B1,CD66a,Siglec7等,参与保护了机体某些不表达MHCI类分子的正常细胞。
NK细胞通过几种方式识别肿瘤细胞:①激活性受体，如NKG2D可识别人肿瘤表面MHCI相关蛋白(MIC)和UL-16结合蛋白(ULBP):②抑制性受体可识别下调自身MHCI类分子表达的肿瘤细胞;③NK细胞表面CD16(FcyRIⅢ)可识别肿瘤细胞表面的抗原-抗体复合物。
NK细胞能够迅速识别、进入并破坏实体组织中的肿瘤细胞，在体内减少转移瘤的数目，延长荷瘤动物的生存期。NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效应主要包括几种方式:①由穿孔素/颗粒酶介导的肿瘤细胞渗透性溶解。在接触到肿瘤细胞后，NK细胞迅速地释放出大量颗粒，这些颗粒中包含有能够破坏靶细胞细胞膜结构的穿孔素(perforin)，使颗粒酶(granzyme)能够进入靶细胞中，诱导靶细胞发生凋亡;②由NK细胞表面的 TNF及FasL介导靶细胞凋亡;③分泌一系列效应分子,如NO,IFN-y等,促进其对靶细胞的细胞毒作用;④破坏或活化肿瘤微血管系统，引起其他效应细胞和淋巴因子渗入到肿瘤组织中，导致肿瘤的出血坏死;⑤通过人抗肿瘤抗体IgG1和IgG3作为桥梁，产生抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，并且,IL-2和IFN-y可增强该效应。

人类NK细胞表面受体和相应配体

4、NKT细胞（natural killer T cells）主要参与机体的微生物免疫、肿瘤免疫和自身免疫，并与过敏现象有关。NKT的T细胞受体是一类特殊TCR，主要识别由单肽性CD1d分子提呈的脂类抗原。
NKT细胞对机体的抗肿瘤免疫效应具有重要意义。研究表明，NKT细胞表达NKG2D体，能够识别多种NKG2D配体以及部分由CD1d呈递的肿瘤脂类抗原。活化的NKT细胞可通过穿孔素和Fas-FasL等途径直接杀伤肿瘤细胞，但更多的情况下，它们能够通过分泌IFN-Y激活NK和CTL的免疫效应。此外,NKT细胞还能够通过CD40和CD40L分子的相互作用刺激APC的活化和分泌IL-12,从而增强下游的一系列适应性免疫应答。
5.yδT细胞尽管yδT细胞表面表达与aβ T细胞膜相类似的yδTCR,但其多样性却十分有限，并且其抗原识别无需MHC分子的辅佐,采取 B细胞受体样的直接识别方式识别其配体或抗原。yδT细胞可识别的蛋白抗原多为应激诱导产生的蛋白分子,其功能兼具T辅助细胞和细胞毒 T细胞的双重效应，发挥作用后,可通过抗原呈递或分泌细胞因子的方式进一步诱导或促进特异性 T淋巴细胞的免疫应答，从而连接固有与适应性免疫两个方面。
yδT细胞在机体的抗肿瘤免疫应答中发挥着重要作用。同NK细胞一样，γδT细胞表达 NKG2D受体，能够直接识别多种肿瘤抗原，某些yδT细胞还能识别肿瘤细胞表面的磷酸化非肽类抗原。活化后的yδT细胞的抗肿瘤效应机制包括:①产生 IFN-y、TNF-a和TNF-β等因子来杀伤肿瘤;②通过穿孔素和颗粒酶等分子直接杀伤肿瘤细胞;③诱导树突状细胞成熟:④表达 CD40等共刺激分子，分泌IL-12,从而激活肿瘤特异性 T淋巴细胞。
6.粒细胞( polymorphonuclear neutrophils, PMN)中性粒细胞表达FcγRⅢB,在受到IFN-γ刺激时还可表达FcγR I，可有效识别IgG-抗原复合物。活化后的中性粒细胞可通过释放活性氧和细胞因子(如TNF-α和IL-1β等)来非特异性杀伤肿瘤细胞，其效应机制与单核巨噬细胞有许多共同之处。

二、适应性免疫应答

(一)适应性免疫的概念和特点

适应性免疫(adaptive immunity)是机体特异性识别和选择性清除外来病原物的免疫反应，是抗肿瘤免疫应答的重要环节。肿瘤细胞表达肿瘤抗原(tumor antigen)是诱导适应性免疫应答的基础。肿瘤抗原是在肿瘤发生、发展过程中出现的新抗原(neoantigen)或异常表达的抗原物质。肿瘤抗原可以被APC捕捉、加工和处理后成为抗原肽段呈递至细胞表面供抗原特异性淋巴细胞识别,进而诱导机体的抗肿瘤免疫应答。
适应性免疫具有特异性(antigenspecificity)、多样性(diversity)、记忆性(immunologic memory )和排他性(self/nonself recognition)的特点。特异性使免疫系统能够识别不同抗原之间的细微差异;多样性则赋予了免疫系统识别数量庞大的外来抗原上特定结构的功能;记忆性是指免疫系统一旦识别了某一特定抗原后就会发生免疫记忆，当机体再次遭遇相同抗原时能迅速产生更强的免疫应答，从而更快地清除病原和保护机体。免疫系统对自身抗原具有免疫耐受性,但对外源性“非己”成分能产生免疫应答并予以清除,这种对“自己”和“非自己”的区分对维持免疫系统的平衡性与稳定性具有重要意义。除此以外,适应性免疫还具有转移性(transfer ability)和耐受性(immunotolerance)等特点。
适应性免疫与固有免疫并非两个完全独立的过程。一方面，固有免疫通过MHC分子将外来抗原呈递给适应性免疫细胞，从而启动了适应性免疫应答，并影响了其强度与持续时间;另一方面，适应性免疫释放的多种因子也反过来募集了更多的免疫细胞，并影响固有免疫细胞的活化程度。这两种免疫系统的共同作用实现了机体抵御外来病原物的自我保护目的。

(二)适应性免疫细胞对肿瘤的识别与免疫效应

1.特异性抗肿瘤细胞免疫 在抗肿瘤细胞免疫中，T细胞介导的特异性免疫应答反应起着重要作用。T细胞能够表达一系列特有的表面分子，其中包括识别MHC分子与抗原复合物的TCR、CD3、CD4/CD8分子，以及大部分成熟T细胞表面的CD28分子(识别B细胞或其他APC表面B7家族共刺激分子的受体)和CD45分子(一种信号传递分子)等。

常见的区分B淋巴细胞与T淋巴细胞的CD分子标记

T 细胞对抗原的识别具有MHC 限制性。表达CD4分子的T淋巴细胞只能识别由MHCⅡ类分子呈递的抗原;而表达CD8分子的T淋巴细胞只能识别由MHCI类分子呈递的抗原。因此,CD4和CD8分子把T淋巴细胞分成了两个最重要的功能亚群:辅助性T细胞(Thelper cells, TH)和细胞毒性T细胞(Tcytotoxic cells,TC或 cytotoxic T lymphocyte,CTL)。TH细胞主要通过分泌多种细胞因子对免疫反应发挥调节作用，而TC细胞则主要作为效应细胞特异性地杀伤靶细胞，同时具有维持抗肿瘤免疫记忆的功能。TH和TC细胞根据功能上的差异还能够再细分为 TH1、TH2、TC1和TC2 四个亚群，其中参与抗肿瘤细胞兔疫反应的主要是THI和TC1这两种T细胞亚群。
T淋巴细胞表面TCR识别肿瘤抗原的形式有两种:①肿瘤细胞扩散至淋巴结，肿瘤抗原以 MHCI类分子限制性的方式供CD8⁺T淋巴细胞识别:②脱落的肿瘤细胞或可溶性肿瘤抗原被 APC摄取、加工和提呈，以MHCII类分子限制性的方式供CD4'T细胞识别,或者以交叉提呈的方式供CD8⁺T细胞识别。
CD4⁺TH淋巴细胞发挥抗肿瘤免疫应答的重要辅助作用，其介导的抗肿瘤免疫机制有几种:①活化的CD4⁺TH1细胞可辅助CD8⁺CTL激活，同时，它们分泌的IL-2及肿瘤微环境中其他细胞分泌的IL-15能够促进和维持CD8细胞的功能与活性;②活化的CD4⁺TH2细胞参与辅助B细胞产生特异性抗肿瘤抗体;③活化的CD4⁺T淋巴细胞可辅助固有免疫细胞(如NK细胞、DC)的活化;④部分活化的CD4⁺T细胞可直接杀伤肿瘤细胞。
CD8⁺TC淋巴细胞负责杀伤肿瘤细胞,是抗肿瘤免疫应答最主要的效应细胞,其介导的抗肿瘤免疫机制包括:①通过穿孔素和颗粒酶等杀伤靶细胞;②通过表面的Fas配体与肿瘤细胞表达的Fas受体结合，从而启动肿瘤细胞凋亡;③分泌 IFN-y、肿瘤坏死因子、淋巴毒素等间接杀伤肿瘤细胞。此外，CD8⁺CTL细胞具有免疫记忆功能，在相同肿瘤抗原再次刺激后，能很快分化成效应细胞，并显示杀伤活性。

2.特异性抗肿瘤体液免疫 与T细胞介导的抗肿瘤细胞免疫不同,B细胞能够通过其表面受体(Bcell receptor,BCR)直接识别并结合可溶性抗原。

抗肿瘤抗体药物具有以下几个特点:

(1)高度的特异性:针对特定的某一肿瘤抗原表位，具有高度的特异性，这是该药物发挥作用的重要基础。特异性主要表现为特异性结合，选择性杀伤靶细胞，体内靶向性分布以及具有更强的疗效。
(2)高度多样性:主要表现为分子靶点(抗原)的多样性，抗原表位多样性，抗体结构的多样性、抗体活性的多样性等方面。
(3)制备的定向性:抗体药物最重要特点是可以定向制造，即根据患者的实际情况，制备具有特定治疗作用的抗体药物。目前，所有的抗肿瘤抗体药物都是针对特定的分子靶点定向制造的。抗体与化疗药物的偶联物或融合蛋白兼有抗体和化疗药物两者的生物活性。特定的化疗药物与不同的抗体偶联或融合，可以作为一种技术平台，制备系列化的抗体药物。
B细胞是体内唯一能够产生抗体(免疫球蛋白分子，immunoglobulin)的细胞,表达一系列具有特定功能的表面标记，其中包括:①B220,通常被作为识别B细胞及其前体细胞的标记，但其表达并不仅限于B淋巴细胞;②主要组织相容性抗原 MHCII,使B细胞能够发挥抗原提呈细胞的作用;③CR1(CD31)和CR2(CD21),补体受体:④Fcγ5RⅡ(CD32)，识别IgG;⑤B7-1(CD80)和 B7-2(CD86)，能够与T淋巴细胞表面的CD28或 CTLA-4分子相互作用,提供共刺激或共抑制信号;⑥CD40,对维持B细胞活性、促进浆细胞与记忆性B细胞的分化具有重要作用。
B细胞表面的BCR可直接识别肿瘤抗原肽，一个B细胞表面大约有1.5x10⁵个提供单一抗原结合位点，识别相同抗原的抗体分子。在APC参与和CD4⁺T细胞的辅助下,B细胞能够对肿瘤细胞分泌的可溶性抗原或肿瘤细胞膜抗原产生应答，并分泌抗肿瘤抗体。抗肿瘤抗体的作用机制有:①通过体内能发挥ADCC作用的效应细胞，包括中性粒细胞、NK细胞和巨噬细胞等来起作用;②补体介导的细胞溶解作用;③抗体使肿瘤细胞的黏附特性改变或消失，从而有助于控制肿瘤细胞生长和转移;④封闭肿瘤细胞上的某些受体，抑制肿瘤细胞的生长;⑤调理作用，促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞。

生活很好，有你更好，下一篇我们总结肿瘤免疫逃逸。