NAR：RCMS编辑系统在特定细胞RNA位点的靶向m5C甲基化和去甲基化研究

2024年2月15日，吉林大学张涛、赵飞宇、李金泽为共同第一作者，吉林大学李占军、隋婷婷及赖良学为共同通讯在《Nucleic Acids Research》（NAR/ IF14.9）发表题为“Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase”的研究论文，通过m5C RNA-BS等分析揭示RCMS（reengineered m5C modification system）编辑系统能够精确地在特定RNA位点掺入或去除m5C修饰，改变细胞转录本的稳定性。此外，RCMS编辑系统还调控tRNA m5C水平，影响细胞的转录本丰度、细胞增殖和迁移能力。

标题：Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase（通过dCasRx偶联的甲基转移酶和去甲基化酶实现细胞RNA的可编程m5C修饰）

时间：2024.2.15

期刊：Nucleic Acids Research（核酸研究）

影响因子：IF 14.9

实验方法：RT-qPCR、Western blot、流式细胞术、mRNA BS-seq、免疫荧光显微镜和RNA衰变实验等

研究摘要：

5-甲基胞嘧啶（m5C）是一种丰富的RNA修饰，在调控RNA命运和基因表达中起着至关重要的作用。尽管最近在理解m5C的生物学作用方面取得了进展，但无法在转录本中的特异性位点引入m5C阻碍了揭示特异性m5C与表型结果之间直接联系的研究。本研究作者开发了一种基于CRISPR-Cas13d的编辑系统，名为重编程m5C修饰系统（reengineered m5C modification system，简称RCMS），用于特定转录本中的靶向m5C甲基化和去甲基化。RCMS编辑系统由核定位的dCasRx与甲基转移酶（NSUN2/NSUN6）或去甲基化酶（小鼠Tet2的催化结构域）（ten-eleven translocation 2，TET-2）结合而成，可以在精确m5C位点操纵甲基化事件。研究揭示了RCMS编辑系统可以诱导特异性m5C甲基化和去甲基化。此外研究还证实了RCMS编辑系统在调控转运RNA m5C水平以及通过m5C介导的机制诱导转录本丰度和细胞增殖变化的能力。研究结果共同将RCMS编辑系统确立为一种靶向表观转录组编辑工具，有助于鉴定单基因m5C变化及其可能产生结果。对于深入理解RNA修饰在生物学过程中的作用以及开发新的治疗策略具有重要意义。

研究结果：

（1）可编程m5C编辑系统设计

NSUN6酶验证可编程位点特异性m5Cwriter活性

图1：NSUN6在HEK293T细胞中验证可编程位点特异性m5C writer活性。

将NSUN6甲基转移酶与dCasRx结合以构建RCMS-dCasRx-NSUN6编辑器。

RCMS策略。该策略涉及使用与NSUN6甲基转移酶结合的可编程RNA结合蛋白，如dCasRx，通过靶转录本中特定gRNA方式，诱导从C到m5C的位点特异性甲基化。

RPSA mRNA中m5C位点和gRNA靶向区域示意图。

通过RT-qPCR使用CasRx评估RPSA gRNA的靶向效率（n=3）。

使用HiTOM深度序列分析评估RCMS dCasRx-NSUN6编辑器靶向m5C甲基化后RPSA m5C位点的m5C比率水平（n=3）。

在HEK293T细胞中，使用与非靶向gRNA或RPSA gRNA结合的dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6评估RPSA mRNA水平（n=3）。

用dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6联合非靶向gRNA或RPSA gRNA分析HEK293T细胞中RPSA的蛋白水平。

在用10 mg/ml放线菌素D（一种有效的转录抑制剂）处理的HEK293T细胞中，通过RT-qPCR检查指定时间点的RPSA水平（n = 3）。

“非靶向gRNA”被用作非靶向对照。误差线表示平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.表示双尾不成对双样本t检验不显著。

dCasRx-NSUN2在人类细胞中对内源性转录本的甲基化

图2：dCasRx-NSUN2在人类细胞中对内源性转录本的甲基化。

将NSUN2甲基转移酶分别与dCasRx结合以生成RCMS dCasRx-NSUN2编辑器。

提出带有NSUN2的dCasRx RCMSs策略。

展示KAT7 mRNA中m5C位点和gRNA靶向区域示意图。

RT-qPCR检测KAT7 gRNA使用CasRx的靶向效率（n=3）。

通过RCMS dCasRx-NSUN2编辑器对靶向m5C甲基化后KAT7 m5C位点的C-to-T突变率进行定量，每个条形图上方显示总测试数[dCasRx-Tet2 CD+非靶向gRNA（6/17），dCasRx-Tet2 CD+KAT7 gRNA（15/29），dCasRx-Tet2 CD+KAT7 gRNA（10/29）；n1/n2，n1表示胞嘧啶数量，n2表示总测试数。

HEK293T细胞中，使用与非靶向gRNA或KAT7 gRNA结合的dCasRx-NSUN2分析KAT7 mRNA水平（n=3）。

用dCasRx-NSUN2或dCasRx-dNSUN2联合非靶向gRNA或KAT7 gRNA评估HEK293T细胞中KAT7的蛋白水平。

在用10 mg/ml放线菌素D（一种强效的转录抑制剂）处理的HEK293T细胞中，通过RT-qPCR分析指定时间点的KAT7 mRNA水平（n = 3）。

“非靶向gRNA”用于非靶向。误差线表示平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.表示双尾不成对双样本t检验（n=3）不显著。

通过Tet2验证可编程位点特异性m5C eraser活力

图3：通过RCMS eraser dCasRx-Tet2 CD进行mRNA转录本的靶向去甲基化。

将Tet2 CD（Tet2催化域）分别与dCasRx结合以生成RCMS dCasRx-Tet2 CD编辑器。

提出带有Tet2 CD的dCasRx RCMSs策略。

TRAF7（肿瘤坏死因子TNF受体相关因子7）mRNA m5C位点和gRNA靶向区域示意图。

通过RT-qPCR检测TRAF7 gRNA的CasRx靶向效率（n=3）。

通过RCMS dCasRx-Tet2 CD编辑器靶向m5C甲基化后，对TRAF7 m5C位点的C-T突变比率进行定量检测，测试数字显示在每个条形图上方。dCasRx-Tet2 CD+非靶向gRNA（13/21），dCasRx-Tet2 CD+TRAF7 gRNA（10/19），dCasRx-Tet2 CD+TRAF7 gRNA（12/19）；n1/n2，n1表示胞嘧啶数量，n2表示总检测数。

使用与TRAF7 gRNA或非靶向gRNA结合的dCasRx-Tet2 CD分析TRAF7 mRNA水平（n = 3）。

用dCasRx-Tet2 CD联合TRAF7 gRNA或非靶向gRNA检测HEK293T细胞中TRAF7的蛋白水平。

在用10 mg/ml放线菌素D处理的HEK293T细胞中，通过RT-qPCR检测指定时间点的TRAF7 mRNA水平（n = 3）。

BBS4 （Bardet-Biedl综合征4）mRNA中m5C位点和gRNA靶向区域示意图。

使用RT-qPCR检测BBS4 gRNA使用CasRx的靶向效率（n = 3）。

使用HiTOM分析深度序列对dCasRx-Tet2CD编辑器靶向m5C甲基化后BBS4 m5C位点的m5C比率定量检测（n = 3）

在HEK293T细胞中，使用与BBS4 gRNA或非靶向gRNA结合的dCasRx-Tet2CD分析BBS4 mRNA水平（n = 3）。

用dCasRx-Tet2CD联合BBS4 gRNA或非靶向gRNA评估HEK293T细胞中BBS4的蛋白水平。

RT-qPCR检测10 mg/ml放线菌素D处理的HEK293T细胞在指定时间点的BBS4 mRNA水平（n=3）。

（2）RCMS在tRNA中诱导可编程位点特异性m5C水平

图4：HEK293T细胞中靶向处理tRNA转录本甲基化和去甲基化。

NSUN2-/-细胞系构建示意图。首先用编码BE4max编辑器和靶向NSUN2基因的gRNA的质粒转染HEK293T细胞。转染后，将细胞稀释并接种到96孔板中进行克隆选择，并筛选单克隆细胞的所需NSUN2-/-基因型。

Gln11中NSUN2-/-细胞系的Sanger测序色谱图。

NSUN2-/-细胞系中NSUN2 mRNA水平（n = 3）。

WT细胞和NSUN2-/-细胞中NSUN2蛋白表达的Western blot结果。

人tRNAVal示意图，tRNAVal中三个m5C位点用红色箭头标记。

tRNAVal中gRNA位点示意图。

G-I. 使用dCasRx-NSUN2编辑器在NSUN2-/-细胞系中靶向m5C甲基化后，利用深度序列HiTOM分析tRNAVal的m5C38、m5C48和m5C49位点的m5C比率（n=3）。

J-L. 使用dCasRx-Tet2 CD编辑器在HEK293T细胞中靶向m5C甲基化后，利用深度序列HiTOM分析tRNAVal的m5C38、m5C48和m5C49位点的m5C比率（n=3）。

M. 人类tRNA Lys的示意图，tRNA Lys中的m5C48位点用红色箭头标记。

N. tRNA Lys中gRNA位置示意图。

O. 使用dCasRx-Tet2 CD编辑器在HEK293T细胞中靶向m5C甲基化后，利用深度序列HiTOM分析tRNA Lys的m5C48位点m5C比率（n=3）。

（3）RCMS编辑器在人类细胞中的非靶向甲基化（Off-target methylation）

图5：RCMS dCasRx-NSUN6编辑器的特异性和非靶向甲基化。

通过RCMS dCasRx-NSUN6编辑器靶向RPSA的m5C甲基化后，m5C富集转录本的mRNA水平（n = 3）。

通过RCMS dCasRx-NSUN2编辑器靶向KAT7的m5C去甲基化后，m5C富集转录本的mRNA水平（n = 3）。

用RCMS dCasRx-Tet2 CD编辑器靶向BBS4的m5C去甲基化后，m5C富集转录本的mRNA水平（n = 3）。

用dCasRx-NSUN6或dCasRx-NSUN6和RPSA靶向gRNA或非靶向gRNA转导的HEK293T细胞中m5C甲基化位点的差异富集。顶部代表上述条件下m5C位点的差异甲基化，表明差异甲基化位点具有统计学意义（P＜0.05）。底部代表维恩图，描绘了用于上述比较的所有甲基化m5C位点的重叠。用三个独立的生物学重复进行BS-seq分析。非靶向gRNA用于非靶向。误差线表示平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.表示双向方差分析和Dunnett多重比较不显著。

（4）HepG2细胞中使用RCMS进行可编程RNA m5C修饰

图6：RCMS dCasRx-NSUN6编辑器对HepG2细胞中的RPSA m5C位点进行修饰。

深度序列HiTOM分析在RCMS dCasRx-NSUN6编辑器和RPSA gRNA-150 nt靶向下RPSA m5C234位点的m5C比率（n=3）。

dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6联合非靶向gRNA或RPSA gRNA-150 nt转导的HEK293T细胞RPSA的mRNA水平（n = 3）。

用dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6联合非靶向gRNA或RPSA gRNA-150 nt转导的HEK293T细胞中RPSA的蛋白质水平。

通过RT-qPCR在指定的时间点检测经10 mg/ml放线菌素D处理的HEK293T细胞中RPSA水平（n=3）。

CCK8法检测dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6和非靶向gRNA或RPSA gRNA-150 nt转导的HepG2细胞增殖（n=6） 。

使用dCasRx-NSUN6和RPSA gRNA-150 nt对RPSA进行靶向甲基化的HepG2细胞的划痕实验的代表性图像。在初始划痕后0h和36h记录划痕测量值。比例尺：200微米。

伤口愈合试验的统计分析（n=3）。

图7：RCMS dCasRx-NSUN6编辑器对HepG2细胞中的RPSA m5C位点进行修饰。

利用深度序列HiTOM分析RCMS dCasRx-Tet2 CD编辑器和RPSA gRNA 0 nt靶向下RPSA m5C234位点的m5C比率（n=3） 。

dCasRx-Tet2 CD或dCas-dTet2 CD联合非靶向gRNA或RPSA gRNA 0 nt转导的HEK293T细胞RPSA的mRNA水平（n = 3）。

dCasRx-Tet2 CD或dCasRx-dTet2 CD联合非靶向gRNA或RPSA gRNA 0 nt转导的HepG2细胞RPSA的蛋白水平。

RT-qPCR在指定时间点检测经10 mg/ml放线菌素D处理的HepG2细胞中RPSA水平（n=3）。

CCK8法检测转染dCasRx-Tet2 CD或dCasRx-dTet2 CD和非靶向gRNA或RPSA gRNA 0 nt的HepG2细胞增殖（n=6）。

dCasRx-Tet2 CD和RPSA gRNA 0 nt对RPSA进行靶向甲基化的HepG2细胞中伤口愈合实验的代表性图像。在初始划痕后0和36小时记录划痕测量。比例尺：200微米。

伤口愈合实验的统计分析。

研究小结

本研究标志着RCMS作为一种靶向表观转录组编辑工具的开创性建立，并探讨了其潜在应用。研究揭示了RCMS的广泛功能，允许在跨RNA靶标中进行精确的位点特异性m5C掺入或去除。这以甲基化依赖性方式改变了细胞转录本稳定性。研究新开发的RCMS具有特异性潜能可以阐明m5C与表型之间的功能关系，并推进m5C生物学的基础研究。

参考文献：

Zhang T, Zhao F, Li J, Sun X, Zhang X, Wang H, Fan P, Lai L, Li Z, Sui T. Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase. Nucleic Acids Res. 2024 Feb 15. pii: 7608824. doi: 10.1093/nar/gkae110. PubMed PMID: 38366553.