高分文献解析｜CNV很少的血液瘤中如何识别肿瘤细胞？

文献信息

【文章标题】Elucidating minimal residual disease of paediatric B-cell acute lymphoblastic leukaemia by single-cell analysis

【发表杂志】Nat Cell Biol.（IF：21.3）

【发表时间】2022年2月

【应用技术】10x Genomics scRNA-seq，scBCR-seq，WES，Bulk RNA-seq

【关  键  词】急性B淋巴细胞白血病（B-ALL），单细胞测序技术，微小残留疾病(MRD)

闪光点

1、 在国际上首次利用单细胞测序技术（单细胞转录组测序scRNA-seq和单细胞BCR测序scBCR-seq技术）绘制了儿童B-ALL MRD的单细胞图谱；

2、 建立白血病细胞识别分类器（根据BCR克隆多样性识别白血病细胞）；

3、体内外实验验证：针对低氧信号通路关键分子HIF1α的小分子抑制剂能够有效协同化疗药物治疗B-ALL，为儿童B-ALL提供了极具潜在转化应用价值的治疗方案。

方法与结论

样本：健康儿童、B-ALL患儿骨髓血（初诊、D19、复发）

亮点解析

由于拷贝数变异（CNV）在大多数人类肿瘤中很常见（88%）[1]，所以通常而言，利用单细胞测序数据区分肿瘤细胞和正常细胞的常规方法是识别CNV，上一篇推文也给大家介绍了一个从scRNA-seq数据中推断CNV的工具--InferCNV（Vernacular｜InferCNV 帮你从单细胞数据中挑出“害群之马”—肿瘤细胞）。那么，那些不发生或者很少发生CNV的疾病（如造血系统癌症[2]），如何识别恶性细胞呢？本文采用了一种机器学习方法，根据全基因组表达模式来区分白血病和非白血病B细胞，下面结合急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）疾病背景详细说说如何不通过CNV景观区分恶性肿瘤细胞。

图1  血细胞分化图[3]

简单来说，人体有三种血液细胞：红细胞（Erytherocytes）、血小板（Platelets）、白细胞（粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞，T细胞、B细胞、NK细胞），它们由骨髓中造血干细胞（Hematopoietic stem cell）发育分化而来。急性淋巴细胞白血病（ALL）就是由于淋巴母细胞（Lymphoid progenitor cell，图1红框）在骨髓内异常增生，导致病人无法制造出能正常工作的血细胞，从而引发的恶性肿瘤疾病。B-ALL是其中最常见的一种类型，由于其起源于B系淋巴前体细胞（Pro-B）异常增生而得名（图2红圈）。

图2  B细胞分化示意图[4]

众所周知，B细胞是体液免疫的主要细胞，通过分泌抗体产生免疫效应。但它不是生来就能分泌抗体的，是Pro-B细胞通过一系列严苛的筛选和抗原刺激，最终分化发育成为成熟的浆细胞才能产生抗体（图2）。

图3  B细胞分化阶段中表面分子表达模式示意图[5]

为了产生尽可能多种类的抗体，在前b细胞阶段（骨髓中），它们的基因会发生重排重组（图3红框，Pro-B 细胞阶段细胞内部依次发生重链D-J基因重组和V-DJ基因重组），而这个基因重组决定的就是抗体 / BCR的多样性。

在B-ALL疾病中，Pro-B细胞异常增生可能影响D-J基因重组和V-DJ基因重组。

图4  抗体结构示意图（图源：https://www.biostars.org/p/158304/）

编码抗体 / BCR的基因是由许许多多基因片段组成，他们依次排列在染色体上，分为V( Variable )、D( Diversity )、J( Joining )三个区域，每个区域分别有约40、23、6种不同的基因片段（图4B）。每个B细胞需要从V、D、J区域各随机抽取一个片段组成重链，再从λ或κ链中的一个选择一个V区和一个J区片段组合成轻链，最终形成完整的抗体 / BCR（图4C）。

需要注意的是，当B细胞完成一条染色体的基因重组时，会抑制另一条同源染色体的基因重组，即同源排斥，所以一个B细胞克隆只会出现一种V(D)J基因重组，对应一种BCR，只分泌一种抗体。正常人的机体时刻在应对各种各样内源性或外源性的抗原，所以BCR应该是多克隆的。BCR基因检测到单克隆重组往往提示B淋巴细胞系的肿瘤如B-ALL、CLL、MM、B细胞淋巴瘤等。

V(D)J序列多样性的集合称为免疫组库（Immune repertoire, IR），通过结合单细胞测序，可一次性获得大量单细胞的基因表达谱和免疫组库数据，从而实现单细胞分辨率上同时对基因转录本和免疫组库进行高通量测序。

图5  B-ALL两例样本scBCR-seq测序数据

本文使用初诊及治疗后19天的B-ALL骨髓血样本进行WES、scRNA-seq和scBCR-seq，数据显示初诊样本缺乏表达BCR的细胞（图5红框），提示V(D)J重组可能受到干扰，这些患者的白血病细胞中没有完整的BCR表达。

图6  B-ALL两例样本白血病细胞验证

由上文可知，无BCR表达（以及克隆BCR表达，详情见文章详细解析图）的细胞被定义为白血病细胞，而非克隆BCR表达的细胞被定义为非白血病细胞。依据WES结果可知一个患者有MLL-ENL重排、另一个患者有KRAS突变，通过分析这两个患者配对scRNA-seq和scBCR-seq数据，结果显示肿瘤特异性MLL-ENL融合基因及KRAS突变（marker基因）均在无BCR表达的细胞中特异性表达（图6红框），从而验证上面的分类标准的正确性。

图7  分类器工作流程及ROC曲线

本文采用机器学习方法，根据全基因组表达模式来区分白血病细胞和正常B细胞。并利用健康供体细胞、诊断阶段白血病细胞和复发阶段白血病细胞，通过BCR表达进行区分测验，图7h曲线下面积接近1.0，证明该分类器具有良好的效果。

参考文献

[1] Taylor, Alison M et al. “Genomic and Functional Approaches to Understanding Cancer Aneuploidy.” Cancer cell vol. 33,4 (2018): 676-689.e3. doi:10.1016/j.ccell.2018.03.007

IF: 50.3 Q1

[2] Ciriello, Giovanni et al. “Emerging landscape of oncogenic signatures across human cancers.” Nature genetics vol. 45,10 (2013): 1127-33. doi:10.1038/ng.2762

IF: 30.8 Q1 

[3] Mohamed, Mahmoud Shaaban, Mahmoud I. Elbadry, and Chao-Ling Yao. "Stem-cell therapy with bone marrow (hematopoietic) stem cells for intestinal diseases." The Intestine. Academic Press, 2021. 131-145.

[4] Blanc, Veronique et al. “SAR3419: an anti-CD19-Maytansinoid Immunoconjugate for the treatment of B-cell malignancies.” Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research vol. 17,20 (2011): 6448-58. doi:10.1158/1078-0432.CCR-11-0485

IF: 11.5 Q1

[5] Schroeder Jr, Harry W., Andreas Radbruch, and Claudia Berek. "B-cell development and differentiation." Clinical immunology. Elsevier, 2019. 107-118.

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