GST Pull-Down实验

引言

本笔记详细记录了GST pull-down实验的每一步，该实验旨在探究GST融合蛋白（GST-P53）与细胞内其他蛋白（如HSP70）的潜在互作。

实验目的

明确构建GST-P53融合蛋白表达载体的目的，并利用GST pull-down技术沉淀与P53蛋白互作的蛋白，通过Western Blot（WB）验证P53与HSP70的潜在互作。

实验材料和方法

材料

· DL2000 DNA Marker（YEASEN，cat.No 10501ES60）

· 琼脂糖（BIOWEST，cat.No 111860）

· GST pull-down试剂盒（Ruqi.biotech，cat.No RQ0085）

主要仪器

· 凝胶成像仪（勤翔，cat.No 6100）

· 高速离心机（Eppendorf，cat.No 5810R）

方法概述

1. 捕获蛋白制备

· 细胞收集与洗涤

· 裂解细胞，并获取上清

· 保留一部分上清作为input样本

2. 诱饵蛋白制备

· 对GST-P53表达菌液进行洗涤和裂解

· 磁珠的准备和与诱饵蛋白结合

1. GST pull-down操作

· 结合诱饵蛋白与捕获蛋白裂解液

· 洗涤和裂解磁珠上的蛋白复合物

· 收集上清以进行后续分析

2. 银染与WB结果

· 详细银染步骤，从固定到最后的水洗涤

· 对银染和WB结果的描述和分析

实验原理

GST pull-down实验基于亲和层析的原理，通过GST融合蛋白与GSH磁珠的结合，实现与目标蛋白的物理性互作沉淀。详细解释了实验中蛋白-蛋白互作的分子机制和该技术如何使我们能够研究这些相互作用。

结果分析

详细记录了银染和Western Blot的实验结果，并对数据图像进行分析，评估GST-P53与HSP70互作的证据，并探讨实验结果的意义。

实验讨论与应用

讨论GST pull-down技术在验证蛋白

互作中的应用和局限性，以及该实验结果对于理解P53蛋白在细胞应答机制中的作用的科学意义。深入探讨实验结果对于未来癌症研究以及可能的治疗方法开发的潜在影响。

实验操作的注意事项

· 阐述诱饵蛋白与GST融合的重要性，以及在实验中如何保证融合蛋白的活性。

· 描述细胞裂解条件对实验结果的影响，包括Protease inhibitor及PMSF的使用以保护蛋白质不被降解。

· 详细说明磁珠处理的操作要点，包括磁珠的选择、洗涤、和蛋白结合的最佳条件。

实验的数据处理与统计分析

· 阐述如何通过凝胶成像系统和相关软件对电泳条带进行定量分析。

· 描述Western Blot结果的定性分析流程，包括膜转移、抗体孵育以及信号的检测。

实验结果展示

WB实验结果

GST-银染检测

总结

总结本次GST pull-down实验的关键发现，并提出后续研究的建议，包括可能的实验改进、进一步的验证实验，以及本实验结果如何为未来研究P53相关疾病提供信息.