最新10+单细胞泛癌分析，揭示肿瘤相关成纤维细胞的亚型，并筛选靶向药物，值得模仿！

影响因子：10.6

研究概述：癌症相关成纤维细胞（CAFs）在肿瘤微环境中尤为突出，在塑造癌症进化、血管生成、转移、免疫调节、代谢重编程和治疗耐受性方面发挥着关键作用。尽管α-SMA、FAP和S100A4等公认的 CAF 标志物有助于 CAF 的鉴定，但 CAF 固有的异质性给确定不同的 CAF 亚群鉴定带来了挑战。在这项研究中，作者利用泛癌症单细胞转录图谱对CAFs进行了新的分子分类，揭示了它们的进化和临床意义。通过利用九种实体瘤的scRNA-seq数据集，作者鉴定出四个不同的CAF分子集群：祖细胞CAF（proCAF）、炎性CAF（iCAF）、肌成纤维细胞CAF（myCAF）和基质生成CAF（matCAF）。每个亚型都显示出独特的分子特征、进化轨迹、功能作用和临床意义。该研究揭示了CAF亚群在肿瘤发生和发展过程中的演化路径，为针对实体瘤中CAF的治疗提供了新的见解。研究流程如下：

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研究结果：

构建和分析泛癌症 CAF 图谱

作者收集了来自 210 名患者近 50 万个细胞的 scRNA-seq 数据，涵盖 12 种不同的癌症类型，包括BRCA（5 名患者的 27 890 个细胞），CHOL（10 名患者的 40 026 个细胞），COAD（33 名患者的 54 432 个细胞），STAD（22 名患者的 38 390 个细胞），LIH（7 名患者的 31 235 个细胞），LUAD（58 名患者的 207 876 个细胞），NEPC（6 名患者的 20 962 个细胞），PAAD（35 名患者的 96 063 个细胞），PRAD（13 名患者的 35 659 个细胞），UCEC（6 名患者的 39 101 个细胞），OV（4 名患者的 27 764 个细胞），UVM（11 名患者的 59 915 个细胞）。每个数据集都经过了标准的单细胞数据分析程序，包括过滤、降维和聚类，随后成纤维细胞被分为两大类：正常成纤维细胞（NFs）和CAFs，并进一步分为四种不同的亚型：proCAF、matCAF、myCAF 和 iCAF，确定这些分类后，作者进行了伪时间分析，揭示了这些 CAF 亚型的发展演变过程（图A）。图B饼图表明CAF 亚群在不同癌症类型中的流行率存在显著差异，如在BRCA中观察到大量的 matCAF，而在 LIHC 中则完全没有这种亚型。图C和D展示了各癌症中NFs和CAFs的marker，图E-H展示了STAD、LUAD、COAD 和 BRCA数据集中的拟时序分析结果，发现NFs和CAFs确实在发育轨迹上符合先前的认知。

四种 CAF 亚型中不同生物标志物的鉴定和特征描述

作者对泛癌中的CAFs进行了进一步的亚群鉴定，图 2A-H全面展示了这些 CAF 亚型及其特定marker在不同癌症中的分布情况。在UMAP 上，proCAF 和 iCAF较为接近，matCAF 和 myCAF 也是如此，这预示着表达模式的相似性。为了进一步验证TME中每种CAF亚型的独立存在，作者对STAD、LUAD和COAD患者的标本进行了染色，结果表明同一组织样本中的 CAF 亚型具有不同的空间分布（图 C、G、M）。iCAFs分布在整个肿瘤间质中，通常位于血管附近，myCAF 和 matCAF 亚型的分布更为集中，这表明它们在发挥功能作用时可能存在协同作用。单细胞水平的三维 PCA 图表明：matCAF 簇在所有癌症类型中都是一致的，表明 matCAF 在实体瘤中具有高度稳定的遗传特征（图 J）。此外，同一 CAF 亚型特异性标记物的表达水平显示出高度正相关，尤其是 matCAF 内的标记物（图 K）。这些发现表明了 matCAF 是一个独特而明确的实体。为了验证这些marker的可靠性，作者分析了TCGA泛癌队列，结果表明这些生物标志物的表达水平在不同癌症类型中表现出一致性（图 L）。

CAF 亚型转录因子的激活多样性

在鉴定出四个不同的 CAF 簇之后，作者转而分析功能。由于转录调控网络通常控制着细胞功能，作者应用 SCENIC 方法在泛癌症单细胞基因表达数据集中识别关键 TFs，识别出 LUAD、STAD、COAD中每种 CAF 亚型中最活跃的 20 个 TFs（图 A）。为了深入研究转录因子的表达模式，作者对不同形式的癌症进行了全面分析，首先确定了每种癌症类型中每种 CAF 亚型最常见的 100 个 TFs，然后对这些列表进行交叉分析，以确定所有癌症类型中一致富集的 TFs（图 B-E）。在这项分析中，细胞颜色的深浅表示核心调控子网络中 TF 的活性水平，颜色越深的细胞代表活性越高。在 COAD 中，与细胞生长相关的NFIX 主要存在于 proCAF 中，参与免疫反应调节的IRF9 主要存在于 iCAF 中，影响肌生成和血管生成的 MEF2C 则主要存在于 myCAF 中，调控胶原蛋白形成的CREB3L1 在 matCAF 中有独特表达（图 F）。接下来，作者鉴定出每个CAFs的高表达TFs后对其进行了GO分析，在matCAF 亚型中主要表达的基因主要是胶原蛋白家族的成员，iCAF 参与协调免疫反应，myCAF 与收缩活动有关，而 matCAF 负责 ECM 重构（图 H-K）。

CAF 亚型在肿瘤发展中的演变路径

在拟时序分析中，proCAF 始终作为初始群体出现，这证明它被称为 "祖细胞 "是正确的，proCAF 生物标记物在开始阶段普遍存在，而 iCAF 和 matCAF 生物标记物的表达则随着肿瘤的发展而逐渐增加，myCAF 生物标志物在肿瘤晚期达到高峰，而其他三种 CAF 亚型生物标志物在这一阶段的表达量极低（图 A-C）。作者还在LUAD特异性CAF scRNA-seq数据集中采用了RNA速度估算，区分了未剪接和剪接的mRNA（图D）。另外，作者使用内部scRNA-seq数据集追踪了STAD进展过程中各种CAF亚型分布的动态变化（图E）。南京STAD队列的UMAP图显示了癌症不同阶段CAF亚群的变化，随着STAD的进展，myCAF和matCAF的表达量也在增加（图F）。气泡图突出显示了 STAD 中亚型特异性生物标志物的表达水平，揭示了每种生物标志物在其相应 CAF 亚型中的比例和平均表达水平的增加（图 G）。此外，STAD 和 COAD 的 mIF 图像强调了不同 CAF 亚型生物标志物表达的变化（图 H），小提琴图也描述了这些变化（图 I）。这些结果表明，在肿瘤进展过程中，CAF 亚型的演变呈现出一种动态模式，proCAF 和 iCAF 在癌症早期占主导地位，而 myCAF 和 matCAF 则在晚期更为普遍。

细胞环境中不同 CAF 亚型之间的通信网络

为了深入研究 CAFs 的功能，作者研究了TME中的细胞通讯（图 A、B），在各种癌症类型中观察到了一致的模式。iCAF 亚型在 CCL通路中发挥作用，matCAF 亚型参与了 PERIOSTIN 通路，proCAF亚型与IGF通路有关，对细胞增殖和发育至关重要，影响着TME内的各种细胞类型，myCAF 亚型与血管生成素和血小板衍生生长因子途径有关，有助于血管生成，主要作用于内皮细胞和 matCAF。随后作者将癌症分为 "热 "肿瘤和 "冷 "肿瘤，iCAF生物标记物在 "热 "肿瘤中主要大量存在，但在 "冷 "肿瘤中几乎消失，这可能是 "冷 "肿瘤对免疫疗法耐受（图C）。作者进一步探讨了 "热 "肿瘤TME内 "iCAFs "与其他细胞类型的相互作用，观察到iCAFs 主要通过 CXCL12-CXCR4 配体-受体对与 B 细胞、骨髓细胞和 T 细胞等免疫细胞相互作用，通过 CCL2-ACKR1 和 CXCL2-ACKR1 配体-受体对与实体瘤中的内皮细胞进行通讯（图 D）。图 E 用图形表示了 iCAFs 与免疫细胞和内皮细胞之间的这些主要通讯。总之，这些相互作用不仅加深了我们对 CAFs 如何发挥其功能的理解，而且还指出了它们作为癌症治疗干预靶点的潜力。

CAF 亚型作为预后指标的临床意义

随后，研究转向CAF亚型的临床意义，作者基于TCGA的bulk测序以及临床信息进行了生存分析，发现虽然iCAF、myCAF和proCAF的生物标志物在预后价值方面产生了不同或不确定的结果（图A），但在所有受检癌症类型中，matCAF生物标志物的高表达始终与较差的生存率相关（图B），这突显了 matCAF 生物标志物作为预后指标和治疗靶点的潜力（图 6B）。另外，作者还从胃癌患者组织中发现了两种特异表达 COL10A1 的 matCAF 细胞系（图 C、D），与NF细胞系相比，这些matCAF细胞系在RNA和蛋白质水平上都有较高的COL10A1表达，作者用NF或matCAF细胞系与来自胃癌患者的器官组织建立了三维共培养系统（图E），共培养 15 天后，显微镜分析表明，与 NF 细胞系不同，matCAF 能显著促进患者衍生的器官组织的生长（图 F 左图），与 matCAFs 共同培养的器官组织显示 p-pRb 和 CDK6 蛋白表达减少，p27 蛋白表达增加（图 F 右图）。在 STAD 中，几乎所有 CAF 亚型生物标志物都与患者生存率呈负相关，这表明它们在促进胃癌发生方面发挥了作用，对 STAD 组织芯片进行 OGN 和 ACTA2 IHC

筛选和验证针对 matCAF 的药物

鉴于 matCAF 的促癌作用，作者通过排向小鼠模型共同注射 matCAF 和肿瘤细胞进行了体内实验（图A）。在 BRCA 模型中，与对照组相比，COL10A1 基因敲除 matCAF 组的肿瘤重量明显较小（图 B）。在STAD模型中，体内成像和生物发光分析表明，敲除 COL10A1 的 matCAF 大大降低了 STAD 的腹腔转移能力（图 C）。接下来，作者进一步检索了目前有可能靶向 CAF 生物标志物的药物，作者的目标是找出一种能同时靶向所有三个 matCAF 标志物的药物。虚拟筛选预测 PCC1 是一种与所有三种 matCAF 标记蛋白都有很强结合亲和力的化合物（图 D），药物靶标网络以橙色节点代表三个 matCAF 生物标记物（CTHRC1、COL10A1 和 POSTN），绿色节点表示候选化学物质，直观地显示了这些潜在的相互作用。鉴于其药物-靶标结合机制的可行性，POSTN 成为了药物开发的可行候选对象。在 PCC1 和 12 个 POSTN 残基之间检测到了大量的分子间相互作用（图 E）。PCC1 是众所周知的强效抗癌化合物和潜在的延缓衰老剂，以前没有报道过它能抑制 matCAF。为了评估 PCC1 的药效学，作者用 CAFs 和 MKN45 细胞结合基质凝胶制作了一个皮下肿瘤小鼠模型，然后将其皮下注射到 NSG 小鼠体内。在该模型中，与对照组相比，用 PCC1 治疗的小鼠肿瘤明显较小（图 F、G）。此外，PCC1 治疗后的肿瘤组织切片染色显示 matCAF 密度显著降低（图 H、I）。这些结果凸显了 PCC1 的治疗潜力，还强调了在癌症治疗策略中靶向 matCAF 以抑制肿瘤进展的重要性。

研究总结：

这项研究全面地解析了不同CAF群体在肿瘤发生中的作用，并根据每种 CAF 亚群的分子特征和功能作用开发针对促癌 CAF 的特异性抗 CAF 治疗策略提供了可能。基于泛癌单细胞转录组数据，作者发现了四种CAF亚群：proCAF、iCAF、myCAF和matCAF，每种CAF都有不同的分子特征，这种分类方法始终适用于所研究的所有九种实体瘤类型。这些CAF亚型在各种实体瘤中显示出独特的进化途径、功能作用和临床相关性。最后作者利用已发现的小分子 PCC1 靶向 matCAF，体内外实验显示出了良好的抗肿瘤活性。总而言之，各种亚型的 CAF，尤其是 matCAF，在癌症的发生和发展过程中起着至关重要的作用。以实体瘤中的 matCAF 为靶点的治疗策略具有治疗癌症的巨大潜力。