大肠杆菌Red同源重组原理

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大肠杆菌Red同源重组原理
Red同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼各有40~60 bp同源序列的PCR片段导入宿主菌细胞，利用λ噬菌体Red重组酶的作用，使导入细胞的线性DNA片段与染色体(或载体)的特定靶序列进行同源重组，靶基因被标记基因置换下来^[1]。

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Exo蛋白是λ核酸外切酶，可以结合在双链DNA的末端，从５′端向３′端降解DNA单链，产生３′突出末端；
bet基因编码的Beta蛋白可以介导互补链之间的退火；
gam 基因编码一个分子量为16000Da的多肽，该多肽可与宿主RecBCD核酸外切酶结合，抑制核酸外切酶活性，防止外源DNA 进入细胞后被宿主降解；
这３种蛋白协同作用，促进同源重组的发生。

1. 两步同源重组法

两步同源重组法

1）将pKD46转化入宿主菌中，使其能够表达λRed重组酶。
2）以pKD3或pKD4为模板，PCR合成一段两端与目的基因同源、中间含有抗性基因的双链打靶DNA。将该片段电转化入宿主细胞。L-阿拉伯糖诱导重组酶的表达，在重组蛋白的作用下，打靶DNA和细菌染色体基因的同源处发生交换，将抗性基因置换入宿主染色体，使其获得相应抗性，复苏后抗性平板筛选得到突变子。

抗性是为了打靶时候筛选正确重组的阳性克隆，但是构建突变，本身并不需要这个抗生素基因。

3）将质粒pCP20电转化入宿主，利用其表达的FLP(flipase recognition targe)翻转酶将染色体上的抗性基因敲除，得到重组框架正确的突变株。

弊端：

该方法需要将外源DNA电转化入宿主细胞，因此对DNA片段的浓度以及感受态的效率要求较高。然而某些菌株对外源ＤＮＡ 的吸收效率不高，进入细胞的DNA 量往往不足以进行同源重组。同时，电转化会导致大量细胞死亡，只有很少部分宿主细胞能存活。导致两步同源重组法在这些菌株中未能实现成功敲除。

2. 双质粒基因敲除法

2.1 Gene gorging法^[2]
通过酶切方法将打靶序列以及归巢内切酶酶切位点（I-Sec I归巢内切酶识别的长18bp的特异序列）克隆于质粒上。I-Sec I识别位点位于打靶序列两侧。辅助质粒pACBSR上整合了表达Red重组酶和I-Sec I内切酶的基因。在阿拉伯糖诱导下，表达的I-Sec I内切酶特异性切割供体质粒，产生打靶DNA。同时，Red重组酶则促进打靶DNA与宿主染色体同源序列之间的重组，实现基因敲除。
弊端：不使用任何筛选标记，假阳性问题；大部分克隆仍含有pACBSR，只有很小部分消除了该重组质粒。

2.2 Gene doctoring法

与Gene gorging法类似，但在其基础上增加了筛选条件，提高了筛选率，此外供体质粒pDOC还携带sacB 基因。辅助质粒pACBSCE含有λ-Red重组酶基因和I-Sec I内切酶基因。

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SacB基因在大肠杆菌中表达蔗糖：2,6-对-D-果聚糖6-3-D-果糖基转移酶，在培养基中含有5%蔗糖的条件下，会导致菌株毒性，这是因为蔗糖分解后产生的果糖在大肠杆菌中聚集导致的。
虽然产生了同源重组，但是细胞内还是含有供体质粒。通过在培养基中添加蔗糖，由于蔗糖存在时，sacB基因编码的蛋白（蔗糖：2,6-对-D-果聚糖6-3-D-果糖基转移酶）可以将蔗糖转化成果糖，而果糖的积累对大肠杆菌产生毒性，在这种压力的作用下，能够丢掉质粒的菌株便可存活，而无法丢掉质粒的，那就死翘翘了。

该方法不仅继承了Gene gorging法高打靶效率的优点，并且增加了筛选标记，在完成基因敲除的同时消除了同源重组辅助质粒，提升了筛选效率。

3.单质粒敲除法

质粒pREDI携带有２个独立的启动子：一个为阿拉伯糖启动子，可诱导λ-Red重组蛋白表达，介导带标记的线性ＤＮＡ打靶片段与目的基因区域的置换；另一个为鼠李糖启动子，诱导I-SceI归巢内切酶的表达，切割基因组，促进双链断裂实现分子内重组。剔除筛选标记后，完成基因组的修饰^[3]。

为了敲除大肠杆菌基因组Ａ区与Ｃ区之间的基因片段，通过PCR克隆出包含正筛选标记（CmR氯霉素抗性）、负筛选标记（sacB）、１个归巢内切酶酶切位点和３段同源区（A-C）的线性DNA打靶片段。

将线性DNA打靶片段电转化入含有质粒pREDI的大肠杆菌中，涂布于含有阿拉伯糖的培养基上生长。在pREDI表达的重组酶作用下，打靶片段与目的基因发生置换。将菌株从含有10 mmol/L阿拉伯糖的培养基转移到含有10mmol/L鼠李糖的培养基中，诱导I-Sec I归巢内切酶的表达。归巢内切酶切割染色体上的I-Sec I酶切位点，形成DSB（双链断裂模型）。DSB介导两个同源区（boxC）之间的重组，去除外源整合片段，达到无痕修饰的目的。

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1. Murphy KC. Use of bacteriophage lambda recombination functions to promote gene replacement in Escherichia coli. J Bacteriol. 1998 Apr;180(8):2063-71. ↩

2. Herring CD, Glasner JD, Blattner FR. Gene replacement without selection: regulated suppression of amber mutations in Escherichia coli. Gene. 2003 Jun 5;311:153-63. ↩

3. Yu BJ, Kang KH, Lee JH, Sung BH, Kim MS, Kim SC. Rapid and efficient construction of markerless deletions in the Escherichia coli genome. Nucleic Acids Res. 2008 Aug;36(14):e84. ↩