合作文章（IF=12.8）|宏基因组+16s测序助力黑水虻富集活性污泥重金属调控机制的研究

发表期刊：Water Research

影响因子：12.8

测序技术：宏基因组、16s

研究背景

我国每年各类污水活性污泥年产生量超7000万吨，尤其是富含铅（Pb）、砷（As）等相关重金属，暴露于高水平的Pb和As可诱发贫血、皮肤损伤、神经系统疾病和癌症。整体环境风险高，而且处理难度大。黑水牤幼虫（BSFL）能有效地将食物废弃物和污水活性污泥转化为蛋白质饲料和有机肥，为鱼、家禽和植物提供提供优质的营养。但是在黑水牤消化污水活性污泥的过程中，铅（Pb）和砷（As）的积累和转化情况尚不清楚。

2024年2月29日，华中农业大学工学院农业生物质增值利用技术与装备团队袁巧霞教授课题组在环境学科领域知名国际学术期刊Water Research上发表了题为“Biotransformation of Pb and As from sewage sludge and food waste by black soldier fly larvae: migration mechanism of bacterial community and metalloregulatory protein scales”的研究论文。本研究采用16s rRNA和宏基因组测序技术，揭示了黑水虻无害化处理污水活性污泥过程中虫体肠道微生物群落及功能基因对重金属Pb和As迁移转化的调控机制，阐明了Pb、As重金属在虫体、虫沙中的赋存形态、演化规律及迁移转化路径，该研究成果为黑水虻无害化、资源化转化处理活性污泥提供了科学依据。百易汇能生物在本研究中承担了宏基因组测序分析工作。

研究内容及结果

01  Pb和As形式的转换模式

Pb和As的形式是重点关注的，因为与重金属（HMs）的生物利用度有关。随着初始污水活性污泥中Pb浓度的增加，BSFL残基中的有机物结合态F4（31%~44%）增加，而可用形式可交换态（F1）和碳酸盐结合态（F2）减少（57%-41%）（图1b）。在图1a、c中，Pb和As形式在BSFL体内的分布相对平均（20-30%）；同时，有机物结合态F4（30-50%）在BSFL虫沙中分布最为广泛（图1e，f）。以上结果表明，BSFL的生物转化可以降低Pb和As的生物利用度，这可能与细菌的活性有关。

图1 铅、砷形态的变化与分布

02  Pb和As在BSFL吸附过程中的迁移规律

污水活性污泥被BSFL消化后，部分Pb和As在BSFL体内积累，另一部分被排泄到BSFL粪便和污泥残渣中。在BSFL体中（图2a，c）中，Pb和As的相对增量分别从51 %下降到17 %和53 %下降到22 %。而BSFL虫沙中的相对增量更为稳定（图2b，d）。这些结果表明，在BSFL体内，Pb和As的浓度有一个上限。当Pb和As的初始浓度分别小于95和30 mg/kg时（图2e），在检测线以下的BSFL残留物中的Pb和As（≤50和15mg/kg），此外，Pb和As的浓度与初始污水活性污泥中的HMs呈正相关，这与图2f中的拟合结果相似。

图2  铅、砷浓度的变化与分布

然而，浓度的持续增加并不意味着Pb和As在BSFL体内无限期积累。随着初始污水活性污泥中Pb和As浓度的增加，Pb在BSFL体内的分布减少（46-34%，图3a），而As的分布则呈增加趋势（32-44%，图3b）。大部分的Pb和As（52-68%）迁移到BSFL残基中（图3c）。生物积累因子（BAF）的线性拟合结果表明，BSFL更容易积累低浓度的Pb（< 60 mg/kg）和高浓度的As（> 45 mg/kg）（图3d）。这些结果表明BSFL积累Pb和As的能力取决于环境浓度。

图3 铅和砷的分布及生物积累因子（BAF）

03  铅和砷胁迫下细菌群落的演化

微生物多样性分析显示：变形菌门和厚壁菌门在门分类上的相对丰度最高，厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度降低了28-92%，而变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度升高了27-94%（图4b）。只有罗氏菌（Romboutsia）和乳酸菌（Lactobacillus）在属水平上持续下降，而普罗威登斯菌属（Providencia）、肠球菌（Enterococcus）、梭状芽孢杆菌（Paraclostridium）和摩根菌（Morganella）则有所增加（图4c，d）。在幼虫肠道，梭状芽孢杆菌远高于肠球菌。在种水平上，乳酸菌的丰度较高（图4e、F）。此外，作者还监测了BSFL残渣态中细菌群落的变化（图5）、

图4 在门、属和种水平上幼虫肠道细菌丰度的变化

在门、属和种水平上，厚壁菌门、乳酸菌、罗氏菌等的丰度最高（图5a，b，c）。厚壁菌门、罗氏菌的丰度分别增加了46 %、71 %，而乳酸菌则下降了30 %（图d，e，f）。

图5 BSFL残渣态在门、属和种尺度上的变化

04  细菌群落和MRPs对Pb和As迁移的影响

金属调节蛋白（MRPs）的表达也受到幼虫肠道菌群变化的影响。ZntA可转运和稳定Zn（II）和Pb（II），介导对Pb（II）毒性的抗性，并将其传递到目标酶。亚铁离子通过金属离子结合位点与底物结合蛋白EfeO结合，随后通过EfeB或EfeU进入细胞质。由于Pb没有特定的转运体，它与Fe2+竞争二价离子转运体，如EfeO。CadC是一种金属响应性转录因子，可与CadA结合，控制Pb的转运和调控。在Pb胁迫下，ZntA和EfeO这两种转运体的表达量分别增加了34-36%和51-63%，CadC的表达量则降低了52-78%（图6a）。在细菌中，抗As基因通常位于Ars操纵子中，其表达由ArsR转录抑制因子控制。ArsB是第一个被鉴定为可与ArsA结合催化ATP摄取的As（III）外排系统。ArsD是一种金属伴侣，它将As（III）传递给ArsA，增加了其对As（III）的亲和力。有趣的是，这些基因的表达是在As-45组和As-75组中均表达上调（图6b）。这种变化可以解释BSFL体内高浓度的耐受性和积累。基于肠道微生物区系和MRPs的变化，利用冗余分析（RDA）研究了细菌微生物区系与Pb和As的浓度和分布的关系，如图6c和d所示，乳酸杆菌分别占Pb和As变异的48.1 %和58.6 %。此外，乳酸菌显著影响Pb和As的BAF（图6e）。此外，肠球菌也起着显著的作用，有利于As在BSFL肠中的积累，但不利于Pb。（图6c，d）。

图6 金属调节蛋白（MRPs）表达的变化及相关冗余分析（RDA）

05  细菌群落和pH尺度上Pb和As形式的相关性分析

如图7a和c所示，在Pb中，乳酸杆菌和肠球菌形态变化分别占43 %和34 %，不同的是，乳酸杆菌有利于Pb转化为F3，而肠球菌有利于Pb转化为F1、F2和F4。如图7b和c所示，变形菌门对As型的解释率高达52 %，与有效形态（F1+F2+F3）呈显著正相关，相比之下，厚壁菌门和发酵乳杆菌均与有效形态（F1+F2+F3）呈显著负相关。另一方面，Pb和As形式的转化也取决于细菌作用下pH值的变化（图7f），pH的上升或下降会引起土壤电荷性质、沉淀溶解和配位平衡（如Pb和As的转吸附、碳酸盐的形成和溶解以及锰氧化铁的两性胶体）的变化，从而影响Pb和As形式的转化。作者还发现，L.koreensis显著影响了BSFL虫沙的pH变化（图7d，e），这有利于Pb向稳定态（F4）的转变，以及对可用态的转变（图7a，b）。

图7 Pb和As形式、细菌群落和pH的相关性分析

研究结论

在本研究中，作者借助16 s rRNA和宏基因组测序技术，研究了微生物群落、金属调节蛋白（MRPs）与Pb、As的迁移和转化之间的相关性。在15天的测试期间，BSFL能够吸收34-48%的铅和32-45%的砷进入其体内。研究结果表明，黑水虻转化降低了重金属的迁移性，虫沙中的铅和砷主要是残渣态（31-51%），同时幼虫还可以将32-48%的铅和砷富集在体内。16s 分析表明铅和砷胁迫降低了幼虫肠道中Firmicutes, Romboutsia和Lactobacillus的丰度。宏基因组测序发现在金属反应转录因子CadC的调节下，铅可胁迫刺激P型ATP酶ZntA和底物结合蛋白EfeO的表达，从而实现对铅的结合、转运和排泄。幼虫肠道中多种功能蛋白协同调节As (III)的迁移，ArsD 可将 As (III) 传递给 ArsA，从而提高对 As (III) 的亲和力。ArsA 可结合催化 ATP 对 As (III) 的吸收，并通过砷外排系统（例如ArsB，ArsJ，ArsR和ArsK）排出砷。本研究有助于理解BSFL吸附污水活性污泥中的Pb和As，并为了解BSFL介导的Pb和As迁移过程中产生的因素提供了重要的见解。