1. Author

Peter D. Kwong

邝博士于1995年在哥伦比亚大学获得博士学位，并继续在Wayne a.Hendrickson担任博士后，直到2000年，他被任命为美国国立卫生研究院疫苗研究中心（VRC）结构生物学科科长。自2016年以来，邝博士还是哥伦比亚大学生物化学和分子生物物理学系的兼职教授。邝博士因其定义HIV-1包膜糖蛋白的结构方面及其与抗体的相互作用而获得国际认可。他的奖项包括总统科学家和工程师早期职业奖（2003年）、诺曼·P·萨尔兹曼病毒学奖（2012年）、美国微生物学会选举（2014年）以及多项NIAID功绩奖和NIH主任奖。在过去的几年里，他在VRC的团队一直专注于将结构生物学的原子水平工具应用于开发针对HIV-1和其他病毒病原体的有效疫苗。在哥伦比亚大学，他的工作重点是抗体组学，即抗体识别、开发和改进的信息学。

2. Background

2.1 卷曲螺旋

卷曲螺旋（英语：coiled coil）是一种蛋白质超二级结构，由2－7个α螺旋（最常见的是2或4个）互相缠绕形成麻花状结构。许多具有重要生物学功能（如基因表达调控中的转录因子）蛋白质含有卷曲螺旋。许多含有卷曲螺旋结构的蛋白质具有重要的生物学功能，例如基因表达的调控中的转录因子。含有卷曲螺旋结构最知名的蛋白质有原癌蛋白（oncoprotein）c-fos和jun，以及原肌球蛋白（tropomyosin，一种肌肉蛋白）。

形成卷曲螺旋的蛋白质序列中通常具有序列重复现象，每个重复序列区含有七个氨基酸，被称为七肽重复区（heptad repeat）。卷曲螺旋中螺旋之间相互作用的表面常含有疏水氨基酸，如亮氨酸，而由亮氨酸在相互作用表面的排列就形成了“亮氨酸拉链”。在细胞质这样一个水环境中，两个螺旋排列在一起最好的方式就是将它们的疏水氨基酸相对，而亲水氨基酸则朝外；这样就使得疏水表面不会暴露于水环境中。这种对疏水表面的包埋为两个螺旋的二聚化提供了热力学驱动力。形成卷曲螺旋的α螺旋之间的关系可以是平行的或反平行的，并且这些α螺旋通常采用“左手”型超螺旋。

卷曲螺旋模式图

2.2 GCN4 模体

酵母转录激活剂GCN4是30多种已鉴定的含有碱性区亮氨酸拉链（bZIP）DNA结合基序的真核蛋白中的一种。实验团队以2.9A的分辨率确定了与DNA复合的GCN4-bZIP元件的晶体结构。bZIP二聚体是一对连续的α螺旋，在其羧基末端30个残基上形成平行卷曲的螺旋，并逐渐向其氨基末端发散，穿过DNA结合位点的主槽。螺旋状二聚界面的取向几乎垂直于DNA轴，使复合物看起来像字母T。bZIP单体中都没有扭结或尖锐弯曲。bZIP蛋白家族中保守的碱性区残基与DNA碱基和磷酸氧进行了大量接触。bZIP二聚体与DNA相互作用的细节可以解释GCN4蛋白对AP-1位点的识别。

GCN4 模体模式图

2.3 聚肌胞聚肌胞（PolyI:C）

Polyinosinic-polycytidylic acid (Poly(I:C)) 是双链 RNA 的合成类似物，是一种 TLR3 和视黄酸诱导型基因 I 受体 (RIG-I 和 MDA5) 的激动剂。Polyinosinic-polycytidylic acid 可以用作疫苗佐剂，以增强先天性和适应性免疫反应，并改变肿瘤的微环境，还可以直接触发癌细胞发生凋亡 (apoptosis)。

2.4 CB6F1/J 小鼠

这些F1（第一子代）杂交小鼠是BALB/cJ雌性（C）和C57BL/6J雄性（B6）杂交的后代。F1杂交小鼠在所有基因座上都是杂合的（假设亲本菌株具有不同的等位基因），并且与近交系小鼠一样，它们在遗传和表型上是一致的。F1杂交种通常用于杂交活力，作为一些有害突变的背景，用于组织移植，以确定遗传模式，产生或增强多基因疾病的表达，并提供生理缓冲（对各种应激表现出更广泛的反应）。

CB6F1/J小鼠

3. Methods

1. ELISA

2. 抗原的优化设计

3. 负染电镜

4. 抗体滴度测定

5. 小鼠/恒河猴实验

4. Results

实验团队利用人工结构设计的策略，提出了6个二硫键与2个空穴填充突变可以稳定PIV3三聚体的Prefusion构象。他们利用PIV5作为同源建模的模型，PIV5由三个单体构成，包含了4个结构域：DⅠ/DⅡ/DⅢ/HRB，并且封闭在一个巨大的空腔之中。在完成人工模拟以后，利用抗体PIA174（已被证明可以结合Prefusion构象）来证明了构建的成功性。通过EM冷冻电镜，发现：GCN4 三聚化基序和 HRB 螺旋的 C 末端（包括包含 I474Y 空腔填充突变的区域）是无序的，并且在冷冻电镜重建中未观察到。 其中一种空腔填充突变 (A463V) 位于 HRB 螺旋内，导致相邻螺旋之间的范德华接触增加。 融合前稳定的二硫键 I213C/G230C 在所有三个单体的冷冻电镜重建中都得到了明确的定义，连接了在融合前结构中彼此相邻的七肽重复 C (HRC) DIII 结构域中的两个螺旋。 二硫键 Q162C/L168C 连接两条 β 链，尽管位于 DIII 结构域更无序的区域，但在预融合 F PIV3 结构的冷冻电镜重建中也可见，尽管残基 162 和 168 在融合后形式中间隔为 9.9 Å。 尽管来自不同副粘病毒的融合蛋白的整体形状相似，但它们的结构和包围内腔的蛋白质二级结构元件的拓扑结构不同，被鉴定为稳定融合前 RSV F 的突变也不同。

基于结构设计以后的PIV3 F蛋白构象更加稳定

基于同样的构建策略，也构建了突变体PIV1/2/4的F蛋白，鉴于没有报道的抗体可以区分Pre与Post的构象，实验团队直接EM观察。发现构建相对成功。后续将四种突变体作为四价免疫原，在小鼠和恒河猴上进行免疫，并进行抗体滴度测定发现四价免疫原可以诱导产生强大且高效的抗体，这些抗体可以中和所有4型病毒。但如果减少其中一种，测抗体滴度会大大下降。同时实验团队还发现：在之前免疫的基础上，进行额外的两次。PIV3F蛋白免疫可以诱导产生更为高效的中和抗体。

PIV1-4 F进行四价免疫可引发高滴度中和反应

5. Discussion

作者： Guillaume B. E. Stewart-Jones

通讯作者：Peter D. Kwong

单位：Vaccine Research Center, National Institute of Allergy and

Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD

年份：2018.10.03

期刊：PANS

科学问题 ：设计能诱导广谱HPIV1-4型的抗体的抗原

结论：前期研究表明构象的F蛋白可以引起高的中和滴度，目前机制尚不清楚。一种可能性是，高度中和敏感的表位暴露在蛋白质免疫原结构上，可以与有效的对应中和抗体结合，例如 PIA174 的顶端结合表位和与融合前 RSV F 的位点 Ø 相似的表位。实验团队提出利用多种PIV抗原组合形成多价疫苗，这种多价疫苗将为人类一生中接触的致病性副粘病毒提供广谱免疫力。