亚细胞定位实验原理及方法-20240518

一、细胞与亚细胞的定义

细胞：构成生物体的基本结构单位和功能单位，是生命的物质基础。

亚细胞：细胞内的细胞区域或细胞器，其结构只有在电子显微镜下才能看到，功能与空间相互隔离，有共同维持完整的细胞功能。

亚细胞定位：指某种生物大分子物质或脂类在细胞内存在的具体位置。

二、亚细胞定位原理

利用GFP、RFP等荧光蛋白具有的独特荧光性质和灵敏性，来示踪细胞内的蛋白。将目标蛋白与荧光蛋白的N端或者C端融合，通过瞬转或稳转，使该融合蛋白在 受体材料细胞内 表达，目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器。经过激光共聚焦照射，荧光蛋白会发出荧光，通过观察荧光蛋白在细胞内显示的位置，从而可以确定目标蛋白的亚细胞定位情况，即可对蛋白质进行精确定位。

三、亚细胞定位操作步骤

1、通过一些在线网站预测亚细胞定位

2、亚细胞定位载体构建

（1）引物设计：利用引物设计软件，根据pEGFP-MCS-N1或pEGFP-C1-MCS的酶切位点设计目的基因引物。

（2）载体构建：将PCR产物酶切后插入pEGFP-MCS-N1或pEGFP-C1-MCS，得到表达目的基因与EGFP融合蛋白质的真核表达载体。

3、细胞转染

当细胞生长到对数生长期时，接种到共聚焦显微镜专用的玻璃底培养皿（35mm petri dish，10 mm Microwell）中，培养过夜。当细胞贴壁率达到30%~50%时，将融合绿色荧光蛋白GFP的重组载体质粒和目标细胞器质粒共转染细胞。37℃孵箱培养24~72h。