NOVOPlasty—环状基因组的从头组装工具和异质性/变异检测工具

NOVOPlasty 是一种用于短环状基因组的从头组装工具和异质性/变异检测工具。

1. 寻找合适的种子序列（seed）

有三种种子序列类型可选择：

（1） 数据集中来自细胞器基因组的单个读段（如rbcL）。首选

（2）来自同种或相关物种的细胞器序列。

（3）更远缘物种的完整细胞器序列（当没有密切相关的序列可用时推荐）。

格式应为标准的 fasta 文件（第一行：> Id_sequence）。对于在线粒体和叶绿体基因组中相似的种子序列要谨慎。使用 RUBP 序列作为叶绿体组装的种子效果很好。

2. 创建配置文件

可以下载示例文件（config.txt）并根据需要调整设置。

配置文件的每个参数将在下面解释。

3. 运行 NOVOPlasty

无需进一步安装：perl NOVOPlasty4.3.1.pl -c config.txt

使用 conda 安装：conda install bioconda/label/cf201901::novoplasty

使用 conda 运行：NOVOPlasty4.3.1.pl -c config.txt

输入的读段优先选择是未压缩的 Illumina 读段（fastq/fasta 文件）文件。

不要过滤或质控！！使用原始的全基因组数据集（只应去除接头序列）。

可以尝试不同的 K-mer。在覆盖率低或种子错误的情况下，建议降低 K-mer（设置在 21~39 之间）！

Configuration file

下面是一个用于叶绿体组装的配置文件示例。为了使组装工具正常工作，配置文件必须具有完全相同的结构。（确保等号后总是有一个空格，并且每个参数都在一行内）

1. Example of configuration file: 

参数解释

Project name = BS

PS：BS为项目选择一个名称，该名称将用于输出文件。

Type = chloro     

PS：三个选择，“chloro” 用于叶绿体组装，“mito” 用于线粒体组装，“mito_plant” 用于植物线粒体组装。

Genome Range = 120000-200000

PS：(最小基因组大小-最大基因组大小) 预期的基因组大小范围。线粒体默认值12000-20000 /叶绿体默认值：120000-200000。如果预期大小已知，可以缩小范围，这在有重复区域时会有用，这可能导致基因组的过早环化。

K-mer = 33    

PS：必须是整数，这是匹配读段之间的重叠长度（默认：33）。如果读段长度小于90 bp或数据覆盖率低，此值应降低到23。对于长度大于101 bp的读段，可以增加此值，但不是必需的。

Max memory= 7

PS：可以选择最大内存使用量，适用于自动子采样数据或内存有限的情况。如果内存充足，请留空，否则写下您可用的内存大小（GB）。例如，如果您有8 GB RAM的笔记本电脑，填写7或7.5（不要在配置文件中添加单位）

Extended log = 0

PS：打印出非常详细的日志，在出现问题时发送给我可能有用（0/1）

Save assembled reads = no

PS：所有用于组装的读段将存储在单独的文件中(yes/no)

Seed Input = seed.fasta

PS：包含种子序列的文件路径，注意：加上路径

Extend seed directly = no

PS：这个选项允许直接扩展种子，而不是寻找匹配的读段。仅当种子来自同一样本且不存在可能的错配时使用 (yes/no)

Reference (optional) =

PS：可不填写，如果有可用的参考序列，可以在此处提供fasta文件的路径。组装仍将是从头组装，但同属的参考序列可用作指导，解决植物线粒体中的重复区域或叶绿体中的倒位重复。不同属的参考序列尚未测试。

Variance detection=

PS：可不填写，如果选择“yes”，还应有一个参考序列（前一行）。它将创建一个vcf文件，包含与给定参考序列相比的所有变异 (yes/no)

Chloroplast sequence =

PS：组装叶绿体时可不填写，包含叶绿体序列的文件路径（仅用于mito_plant模式）。组装叶绿体时可不填写，在组装植物的线粒体之前，必须先组装叶绿体！

Dataset 1:

Read Length = 151

PS: 读段的长度

Insert size = 300

PS:双端读段的总插入大小，不必非常准确，但应接近。

Platform = illumina

PS: illumina或者ion, Ion Torrent 数据的性能明显较低。

Single/Paired = PE

PS: 目前仅支持双端读段。

Combined reads =

PS: 包含合并读段的文件路径（正向和反向在一个文件中）, 有Forward reads和Reverse reads不填

Forward reads = read_1.fastq

PS: 包含正向读段的文件路径（有合并文件时不需要）

Reverse reads = read_2.fastq

PS: 包含反向读段的文件路径（有合并文件时不需要）

Store Hash =

PS: 一般不填写，如果想对一个数据集进行多次运行，可以在本地存储哈希以加速处理（将“yes”写入本地存储哈希）。要运行本地保存的文件，请参阅GitHub页面的wiki部分。

Heteroplasmy 检测在首次拼接运行中不填写。

注意：

（1）双端测序文件不支持gz格式的reads

（2）完美情况下序列拼成环，多数情况存在gap区，需要利用用Geneious等软件查看拼接情况再决定接下来的分析流程。

Reference：

https://github.com/ndierckx/NOVOPlasty