空间单细胞图谱揭示脊椎动物咽部器官的演化起源
作者，Evil Genius
最近真是见鬼了，不是让我关了B站视频，就是举报我的文章，都闲的没事干是么？
昨晚太原又跳桥了，那些有功夫举报我的人，你要是还能说一句好好生活，我就算你还是个人了。
今日参考文章Spatially resolved single-cell atlas of ascidian endostyle provides insight into the origin of vertebrate pharyngeal organs（Science Advances）
文章采用的是华大平台Stereo-seq and single-cell RNA。
其中最感兴趣的是这张图，
大家注意看这张图，对空间点的划分很不一样，刻板印象里华大都是直接bin50、bin100这样的做法，但是这篇文章的划分除了中间部分很规整之外，外围都是不规则的划分，这个地方怀疑采用了细胞分割的技术，但是这个技术做华大课题的时候很少见，我们需要看看这个内容。
- 利用Stereo-seq和单细胞RNA测序技术，构建了海鞘内层结构的单细胞图谱。
知识背景（这部分我们简单了解一下）
- 咽部器官的发育，包括咽缝及其相关器官，代表了后口动物祖先一个显著的形态学创新
- 脊椎动物咽部的复杂性随着颅旁轴中胚层和神经嵴源间质的结合而增加。这就在咽弓内产生了一些附属器官。除了由咽内胚层发育而来的甲状腺外，各种特殊器官也起源于咽原基，包括甲状旁腺、胸腺和听觉器官。
- 内腔是一种独特的咽部器官，仅存在于无脊椎动物脊索动物和无脊椎动物中，是连接脊椎动物和无脊椎动物后口动物进化层次的关键。
- 总之，内质层包含具有不同性质的不同细胞类型。这些细胞类型可能与脊椎动物中具有相同功能的细胞群具有共同的祖先。
- 研究复杂器官进化的基本步骤包括定义和比较器官内的细胞类型。使用单细胞转录组学，可以在单细胞分辨率下定义器官的细胞特征。然而，当分析以特定组织排列模式为特征的器官时，如内层，在特定位置捕获转录组数据变得至关重要。为了深入研究内壁的细胞组成及其在咽器官进化中的作用，使用了一种称为Stereo-seq的空间转录组技术，并结合了10x Genomics提供的高通量单细胞转录组方法。利用这种方法，为尾脊索动物海鞘(Styela clava)内壁横切面构建了一个可定位的细胞转录谱，其中基因组和转录因子已经得到了很好的表征。通过整合单细胞rna测序(scRNA-seq)的三个生物学重复和六个Stereo-seq切片，制作了一个内质层的空间分辨图谱，并定义了23个细胞cluster。使用电子显微镜观察了内层的超细胞结构，进行了原位杂交以验证标记基因的表达，并对各种细胞类型进行了全面的跨物种分析。
结果1、与咽相关的海鞘内壁细胞组成的多样性
为了鉴定内层细胞成分和潜在的脊椎动物同源物，建立了单细胞分辨率的空间分辨图谱。scRNA-seq数据集由10017个有效细胞组成，使用Seurat工作流进行处理。初步定义了scRNA-seq数据集的细胞组成。多种细胞类型，包括免疫细胞、分泌性上皮细胞和血细胞，被发现具有细胞cluster特异性标记。对于Stereo-seq，通过空间条形码DNA纳米球(DNB)检测的表达谱与在文库构建中捕获的单链DNA染色光学图像对齐。根据不同的细胞分布特征，分别在组织密集区和稀疏区采用了方形划分和细胞分离两种细胞分离策略。使用这些方法，我们将DNB点分离成细胞unit，这代表了真实细胞形态的折衷反映。细胞分离后，在6个Stereo-seq切片中获得18371个细胞单位，并进行细胞类型注释。
接下来，整合了来自6个10-μm厚度切片的三个scRNA-seq和Stereo-seq生物重复的数据集，并基于cluster特异性基因表达重新注释了细胞类型。然后将注释投影到空间lanscope上以创建细胞图谱。
单细胞数据和Stereo-seq数据的相似性比较，证明scRNAseq和空间转录组数据集之间的相似性，其实就是证明Stereo-seq数据直接可以当做单细胞数据来用。
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利用hotspot在Stereo-seq数据集中发现了13个具有显著空间自相关性的基因模块。根据空间分布相似性，将这13个基因模块进一步划分为5类
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斑马鱼的内质层和免疫/血液系统相关组织在转录组水平上存在相似性。
Cell atlas construction for the endostyle of the adult basal chordate
结果2、HLR提供了一个庇护血液和免疫细胞的生态位
- 为了在空间分辨的单细胞图谱中识别HLR的细胞组成，选择了由位于稀疏区域的细胞单位主导的细胞cluster。
- 对HLR内的细胞cluster进行了伪时间分析（monocle2 + velocity）
The HLR cell population and trajectory information
结果表明，HLR是血液和免疫细胞产生和维持的潜在中枢。它可能代表了一种与脊椎动物的血液和免疫系统具有同源性的原始淋巴系统。此外，HLR可能作为干细胞中心，促进免疫和血液系统中功能性细胞的产生，可能在补充血液供应中发挥关键作用。
The HLR provides a lymphoid- like niche for blood/immune cell lineages
结果3、Hair cell–like cells与脊椎动物的hair cells具有转录组相似性
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为了描述HCLC和IRFC群体之间的形态特征和关系，我们使用共聚焦和透射电子显微镜进行了可视化。根据基因表达和形态学结果，假设一个具有潜在机械力传感能力的模型。与脊椎动物由毛细胞和突触组成的机械力传感元件不同，海鞘内层的HCLC和IRFC群体形成紧密交错的层。这些细胞cluster从顶端纤毛表面分布到基膜。这种排列可能在没有突触结构的情况下促进神经电信号通过紧密连接的传输能力。
The HCLC cluster defined in zone 3 has transcriptomic similarity with the acoustico- lateralis system
结果4、甲状腺当量元素诱导不同成熟状态的细胞
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为了探索甲状腺样细胞cluster的潜在发育状态，进行了发育轨迹分析。
Homologous cell cluster to the thyroid gland in the endostyle cell atlas
结果5、其他致密组织区域的细胞群揭示了内壁转录组的多样性
除上述区域外，还对致密组织区域的细胞成分和基因表达进行了详细分析。结合HLR的细胞成分和先前对群落海鞘的研究，揭示了内壁的区域细胞成分。在这个图谱中定义的细胞群不仅与之前对内层区域的理解一致，而且还提供了对咽器官进化的见解。
重点是方法部分
细胞分割和DNB assignment
为了获得最终的空间基因表达矩阵，对dnb进行了数据对应和细胞分配。根据单链DNA染色图像中的细胞核进行目标分割，然后将这些目标的轮廓覆盖在相应对齐的基因表达空间图像上。
为此，首先进行图像配准，将单链DNA图像与基因表达矩阵中的坐标对齐。然后通过对每个DNB的唯一分子标识符计数进行颜色编码，将空间基因表达矩阵转换为二维空间图像。同时，对单链DNA图像进行一系列预处理，包括背景噪声滤波和局部对比度增强。然后用DNB的距离(715 nm)代替像素单位，将这些图像转换为真实的物理尺寸。随后，预处理图像数据集与TrakEM2算法对齐，其中组织形态被手动识别并用于特征匹配。基于仿射矩阵对单链DNA图像进行变换，匹配基因表达的空间坐标。
接下来，使用CellProfiler软件检测和分割转化单链DNA图像中的细胞对象。简而言之，使用全局Otsu阈值策略确定核位置，而无需手动注释。使用Mutex Watershed算法自动确定像素是否属于特定的核，从而创建细胞边界。这些分割单元的边界具有预设的对象直径，范围从6到40像素。然后将与每个DNB位置相关的RNA数据根据它们是否位于分割的细胞边界内分配给单个细胞对象。对于密集核所在且无法检测到边界的区域，手动掩盖这些区域并保留15个分区，每个分区的宽度和高度约为10 μm，而不是细胞分割。利用细胞和基因表达的对齐坐标，基因表达矩阵进一步聚集成假定的细胞，准备进行下游分析。
空间的注释
还是要借助单细胞数据注释空间数据
感觉这个空间划分的方法，普通做项目的恐怕很难接触到。
大家需要关注的一个是hotspot，文章在Hotspot identifies informative gene modules across modalities of single-cell genomics，代码在https://github.com/yoseflab/hotspot, 或者https://hotspot.readthedocs.io/en/latest/。
主要的结果示例图
另外一个是dynamo ，文章在Mapping transcriptomic vector fields of single cells（cell），代码在https://dynamo- release.readthedocs.io/.
主要的结果示例
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