8+非肿瘤纯生信，过敏性鼻炎结合哮喘的双疾病分析识别biomarker，值得学习！

影响因子：8.786

关于非肿瘤生信，我们也解读过很多，主要有以下类型
1 单个疾病WGCNA+PPI分析筛选hub基因。
2 单个疾病结合免疫浸润，热点基因集，机器学习，分型等算法等。
3 两种相关疾病联合分析，包括非肿瘤结合非肿瘤，非肿瘤结合肿瘤或者非肿瘤结合泛癌分析

目前非肿瘤生信发文的门槛较低，有需要的朋友欢迎交流

研究概述：

过敏性鼻炎（AR）是哮喘发展的重要危险因素，有效的AR治疗可预防或延缓哮喘发作。因此识别AR与哮喘之间关联、探索气道过敏性疾病的生物标志物，对于AR合并哮喘的促进治疗和预防策略非常重要。

本文通过WGCNA和差异基因分析鉴定AR和哮喘之间共有的关键基因，筛选生物标志物。接着进行GO和KEGG分析CST1中涉及的信号通路，并进行验证分析。随后通过免疫浸润分析，用ROC曲线确定CST1鉴别Th2高哮喘的预测价值。最后构建了ceRNA网络，使用CMap用于探索潜在的治疗药物。

研究结果：

一、与哮喘和过敏性鼻炎相关的关键基因

1.选取GSE19187和GSE67472中标准差值降序排列在前6134/4744(前25%)的基因，采用WGCNA算法构建共表达模块。为保证符合无标度网络，用相关系数R2 >0.90构建网络，进行了网络拓扑分析。无标度网络的相关系数R2和平均连通性均达到稳定状态。无标度网络中连通性呈幂律分布，网络中连通性(k)与p-(k)呈负相关，所构建的网络符合无标度网络分布(图1A;B)。

2.在GSE19187中鉴定出15个模块，大小从1720个基因(绿宝石色)到67个基因(午夜蓝)(图1C)，并计算模块与临床特征之间的关系。使用灰色模块收集未分配给任何模块的基因，并将其排除在进一步分析之外。洋红色模块与AR密切相关(r = 0.55, P = 0.0 0 4)(图1D)，洋红色模块中有57个候选基因与疾病和模块都有很强的相关性。

3. 在GSE67472中鉴定出16个模块(灰色模块除外)，大小从593个基因(绿松石色)到74个基因(浅青色)(图1E)，其中黄色模块与哮喘密切相关(r = 0.63,P=6 e - 1 3)(图1F)，黄色模块中有32个候选基因与疾病和模块均强相关。

4. 通过差异表达基因分析，分别从GSE19187中筛选出24个DEGs，从GSE67472中筛选出19个DEGs。维恩图分析结果表明，CST1、POSTN、CPA3和SERPINB2不仅是关键模块的候选基因，也是AR和哮喘的DEG候选基因。（图1G;表 2）。此外，火山图显示，CST1、POSTN、CPA3和SERPINB2在哮喘支气管上皮和AR鼻上皮中显著上调（图1H;表 3）。这些可能是将AR和哮喘联系起来的关键基因。

表2：4个关键基因与疾病和模块之间的相关性。

表3：WGCNA网络筛选的4个关键基因的差异分析结果。

二、GO 和 KEGG 分析

1. AR患者支气管上皮DEGs的GO分析显示，DEGs主要富集在炎症和免疫反应的BP中。富含DEG的MF项是CXCR3趋化因子受体结合和CXCR趋化因子受体结合（图2A;表 4）。2. 哮喘患者鼻上皮DEGs的GO分析表明，DEGs主要富集于负调控半胱氨酸型内肽酶活性的BP中。富含DEG的MF项是半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性（图2B）。在CC方面，AR患者支气管上皮和哮喘患者鼻上皮中的DEG主要分布在细胞外空间和质膜外侧（图2C）。

表4：DEG的GO富集分析结果。

3. KEGG分析显示，AR患者的支气管上皮DEGs主要参与哮喘、细胞粘附分子、甲型流感、金黄色葡萄球菌感染、造血细胞谱系和细胞因子-细胞因子受体相互作用等信号通路（图2D;表 5）。哮喘患者鼻上皮中的DEG数量较少，KEGG分析中未能富集显著通路。

表 5：DEG的KEGG通路分析结果。

三、关键基因的验证表明 CST1 是上气道和下气道的生物标志物

1. 对GSE41861和GSE101720的分析表明：

CST1的表达水平在AR和哮喘患者的鼻腔和支气管上皮中表达水平均显著上调（图3A）。

此外，AR患者的鼻上皮中SERPINB2的表达水平上调（图3B），

AR患者的支气管上皮中POSTN和CPA3的表达上调（图3C），

哮喘患者的鼻上皮中POSTN和CPA3的表达上调（图3D），

哮喘患者的支气管上皮中SERPINB2、 POSTN和CPA3表达上调（图3E）。

2. STRING数据库显示CST1，POSTN，CPA3和SERPINB2蛋白具有一定的相互作用（最低要求的相互作用分数：0.15）（图3F）。维恩图工具分析显示，CST1是唯一在AR和哮喘患者的鼻上皮和支气管上皮中上调的关键基因（图3G）。这些结果表明CST1有潜力作为统一气道的生物标志物。

四、CST1在上气道和下气道的表达水平呈正相关

1. GSE101720和GSE41861的相关分析表明，CST1在鼻上皮中的表达水平与支气管上皮中的表达水平呈正相关（图4A）。

2. 此外，CST1在AR患者支气管上皮（图4B）和哮喘患者鼻上皮（图4C）中的表达水平与POSTN，CPA4、 SERPINB4的表达水平呈显著正相关。

3. 相关热图显示，无论是在AR患者的支气管上皮还是哮喘患者的鼻上皮中，CST1都是相关系数总和最高的基因（图4D）。

五、CST1在不同合并症中的表达水平

1. 在GSE101720数据集中对AR合并哮喘，AR和健康受试者的鼻上皮和支气管上皮中CST1的表达水平进行了差异分析（图5A;B）。

与正常对照相比，CST1在AR合并哮喘和单独AR的鼻和支气管上皮中表达均上调。

与单独AR相比，CST1在AR合并哮喘患者的支气管上皮中的水平明显升高，而在鼻上皮中没有显著差异。

2. GSE19187数据集进一步证实了这一点：CST1在单独AR和AR合并哮喘（控制或未控制）中的鼻上皮中表达水平相似（图5C）。

六、免疫浸润分析表明CST1与免疫细胞相关

1. 22种免疫细胞的聚类热图显示哮喘患者与对照组的免疫细胞组成无明显差异(图6A)（图6A），正如既往研究报道过的：健康与重症患者气道巨噬细胞和淋巴细胞的比例基本一致。

2. 直方图显示了每个样本中每个免疫细胞的比例（图6B）。分析免疫细胞丰度与CST1表达水平的关系，CST1与活化的CD4记忆T细胞和静息肥大细胞呈正相关，与中性粒细胞、M2巨噬细胞和活化的肥大细胞呈负相关（图6C）。

七、CST1与高Th2哮喘之间的相关性

1. 采用欧氏距离聚类分析，根据2型炎症的3个特征基因（SERPINB2、POSTN和CLCA1）的表达，将32例哮喘患者的支气管上皮样本分到高th2哮喘组，其余19例被分到低th2哮喘组(图7A)。CST1在高th2哮喘组的表达水平明显高于低th2哮喘组，低th2哮喘组与对照组无明显差异(图7B)。

2. ROC曲线表明，在GSE41861数据集中，支气管上皮中的CST1对th2 -高哮喘具有良好的诊断效果(图7C)。此外，鼻上皮细胞CST1表达水平也对th2 -高哮喘有理想的诊断效果 (图7D)。

3. 使用GSE67472数据集验证了CST1在高th2哮喘组、低th2哮喘组和健康对照组中的表达水平(图7E)，以及CST1在鉴别高th2哮喘和低th2哮喘中的诊断效率(图7F)。

Th2细胞因子中，CST1与哮喘患者支气管上皮中的CLCA1、IL-13(图7G, H)以及AR患者鼻上皮中的CLCA1(图7I)显著相关。

八、基因集富集分析

1. 由于CST1是AR和哮喘患者鼻上皮和支气管上皮中唯一上调的关键基因，且相关热图显示CST1是与其他3个关键基因相关性最高的基因，作者推测CST1可能是关键基因中的主要驱动基因，更有可能成为药物治疗的有效靶点。

2. 故选择CST1进行GSEA分析，结果表明CST1高表达组显著参与Fc epsilon RI (FcϵRI)信号通路（图8A）和O-聚糖生物合成 (图8B)。

九、哮喘中的 mRNA-miRNA-lncRNA ceRNA 网络

1. 通过结合TargetScan、miRNet数据库和GSE142237分析结果，作者获得了5种独特的miRNA：①hsa-miR-138-5p、②hsa-miR-146a5p、③hsa-miR-146b-5p、④hsa-miR-34b- 5p和⑤hsa-miR-218-5p，所有这些都在哮喘中下调（图9A）。

2. miRNet数据库预测了两种lncRNA（KCNQ1OT1和NEAT1）参与了所有miRNA的调控（图9B）。最后，构建了包含2个lncrna、5个mirna和3个关键基因的10轴ceRNA网络(图9C)。

十、用于预防合并症的小分子候选药物

1. 将AR患者支气管上皮中的DEGs及其表达趋势导入CMap数据库，预测可能逆转DEGs表达改变的潜在药物。通过富集评分排名筛选了可以逆转DEG的前3种小分子化合物或药物：Alfaxalone，QL-XI-92，Deferiprone。

2. 将哮喘患者鼻上皮中的DEGs上传到CMap，结果显示疣菌素A是两组结果中同时发生且排名最高的药物（表6）。这些化合物有可能预防AR患者哮喘的发展。

表6：利用CMap数据库预测四种化合物

3. GSE89809分析结果表明，皮质类固醇可以下调CST1的表达水平（图9D），ICS的剂量与CST1表达水平呈显著负相关（图9E）。

研究总结：

本研究整合生物信息学技术，通过应用WGCNA分析上气道和下气道的转录组学数据，发现CST1及其相关分子功能在AR合并哮喘中起关键作用，将CST1确定为气道过敏性疾病（尤其是Th2型哮喘）的潜在生物标志物。GSEA结果表明CST1参与FcεRI信号通路和O-糖生物合成，此外构建了包含lncRNAs KCNQ1OT1和NEAT1的ceRNA网络，包括疣菌素A在内的四种药物有可能预防AR患者哮喘的发展。这些研究表明CST1的靶向治疗具有预防AR患者哮喘发展的潜力，值得进一步研究。