客户文章 | 梁振兴/康亮团队揭示环状RNA在结直肠癌中的作用

导读：

缺氧是实体肿瘤的标志之一，导致癌细胞的代谢重编程。在结肠直肠癌(CRC)中，表观遗传调控在缺氧和异常胆固醇代谢之间的作用尚不清楚。

本研究发现了一种新的低氧应答环状RNA circINSIG1，该环状RNA在结直肠癌组织中表达上调，并与晚期临床分期和低生存率相关。机制上，circINSIG1编码一个121个氨基酸的蛋白circINSIG1-121，通过募集CUL5-ASB6复合物(一种泛素E3连接酶复合物)，促进关键胆固醇代谢调节因子INSIG1第156和158位赖氨酸的k48关联泛素化，从而诱导胆固醇生物合成，促进结直肠癌的增殖和转移。原位异种移植肿瘤模型和患者源异种移植模型进一步确定了circINSIG1在CRC进展中的作用和CRC的潜在治疗靶点。

总之，本研究发现的circINSIG1提供了一种表观遗传机制，揭示了缺氧与胆固醇代谢之间的联系，为CRC的治疗提供了一个有希望的治疗靶点。

文章索引

标题：A novel protein encoded by circINSIG1 reprograms cholesterol metabolism by promoting the ubiquitin-dependent degradation of INSIG1 in colorectal cancer.

发表期刊：Molecular Cancer

发表时间：2023.04

作者团队：中山大学附属第六医院梁振兴/康亮团队

IF：37.3

DOI：10.1186/s12943-023-01773-3.

研究概览

研究结果

（1）CRC中缺氧诱导的circINSIG1的表达特征及临床意义

为了鉴定CRC中与缺氧相关的环状RNA，作者在常氧或缺氧(1% O2, 48小时)培养的HCT8、HCT116和DLD1细胞中进行了环状RNA测序。结果表明，这三种细胞系中有18个交集环状RNA失调(图1A)。

然后，作者选择了四个circRNA (circNPHP4、circINSIG1、circGART和circZDHHC5)进行进一步鉴定(图1B)。qRT-PCR分析了这些circRNAs在CoCl2诱导的细胞缺氧模型和32对CRC样本中的表达水平，最终选择circINSIG1 (hsa_circ_0133744)进行进一步研究(图1C)。

作者进一步分析了85个配对CRC样本中circINSIG1的表达水平，证实了circINSIG1在CRC中表达上调(图1D)。进一步分析显示，circINSIG1在晚期T期或临床分期患者中表达更高(图1E-F)。

circINSIG1由胰岛素诱导基因1 (INSIG1)的外显子3和4反向剪接而形成的(292nt，图1G)。Sanger测序验证了circINSIG1的反向剪接连接(图1H)。半衰期分析显示circINSIG1比线性INSIG1 mRNA更稳定(图1J)。此外，circINSIG1可抵抗RNase R的消化(图1K)。核质分离实验和荧光原位杂交(FISH)实验表明，CRC细胞的细胞质中富集了circINSIG1(图1L-M)。

临床样本证实，与配对的正常邻近组织相比，CRC组织中circINSIG1的表达水平升高(图1N)。此外，Kaplan-Meier曲线显示，高circINSIG1表达与CRC患者较差的生存率相关(图10)。综上所述，这些数据证明了circINSIG1的环状特征和临床意义。

[if !supportLists]（2）[endif]circINSIG1编码一个121个氨基酸的蛋白质

为了确定circINSIG1的蛋白质编码潜力，作者首先分析了circINSIG1的序列元件。结果显示，circINSIG1序列中包含一个具有编码121个氨基酸蛋白潜能的跨越连接ORF(以下简称circINSIG1-121)和一个位于207-292nt的IRES(图2A)。

接下来，作者对HCT8进行了Polysome profiling和qPCR分析(图2B)。线性INSIG1 mRNA作为阳性对照，circCAMSAP1作为阴性对照，结果显示circINSIG1可以在单体和多体中检测到。

作者制备了单克隆抗体用于检测circINSIG1-121的表达。circINSIG1-121抗体证实了circINSIG1-121的内源性存在(图2C)。使用过表达circINSIG1的CRC细胞进行质谱分析和SDS-PAGE进一步验证了circINSIG1-121蛋白的特异性肽片段与预测的分子量(图2D-E)。

接下来，分别通过免疫组化(IHC)和western blot分析20例和10例配对CRC样本中circINSIG1-121和INSIG1的蛋白水平。结果显示，circINSIG1-121在结直肠癌组织中表达上调，而INSIG1蛋白水平在配对的正常邻近组织和结直肠癌组织中无显著差异(图2F和G)。

此外，通过免疫组化(IHC)在结直肠癌队列中检测了circINSIG1-121和INSIG1蛋白水平(n = 227)。结果还表明，高circINSIG1-121表达与CRC患者较差的生存率相关(图2H)。相比之下，在本研究队列中或TCGA数据库中，insinsig1的线性表达水平与CRC患者的生存率没有相关性(图2I-J)。

总之，这些数据证实circINSIG1编码一种121个氨基酸的新蛋白，该蛋白与CRC的不良预后相关。

[if !supportLists]（3）[endif]circINSIG1-121促进结直肠癌的增殖和转移

为了阐明circINSIG1在结直肠癌中的生物学功能，作者进行了功能获得与缺失的实验。首先构建了稳定过表达circINSIG1或circINSIG1-121的CRC细胞系(图3A-B)。实验证实circINSIG1或circINSIG1-121增强CRC细胞增殖、迁移和侵袭(图3C，E)。此外，CRC患者源性类器官(PDOs)中过表达circINSIG1或circINSIG1-121，也促进了PDOs的生长(图3D)。

相应地，敲低circINSIG1或circINSIG1-121显著抑制CRC细胞的生长、迁移和侵袭(图3F-H)。

体内实验证实：过表达circINSIG1或circINSIG1-121可显著促进肿瘤生长(图3I-J)。此外，对小鼠肝脏中人类HPRT mRNA表达的分析证实，circINSIG1或circINSIG1-121可导致肝转移肿瘤负荷显著增加(图3K)。总之，这些结果证明了circINSIG1-121在促进结直肠癌增殖和转移中的关键作用。

[if !supportLists]（4）[endif]circINSIG1-121与INSIG1相互作用，促进INSIG1的泛素依赖性降解，诱导胆固醇的生物合成

为了确定circINSIG1-121促进CRC进展的分子机制，作者分析了circINSIG1或circINSIG1-121过表达的细胞中INSIG1的RNA和蛋白水平。有趣的是，INSIG1的RNA水平随着circINSIG1或circINSIG1-121的过表达而升高，而INSIG1的蛋白水平则降低(图4A-B)。此外，通过免疫荧光观察到circINSIG1-121和INSIG1在CRC细胞中的共定位(图4C)。免疫沉淀(IP)实验证实circINSIG1-121与INSIG1相互作用(图4D)。

是什么原因导致了INSIG1的降解呢？首先，作者排除了磷酸化的影响。接着，用蛋白酶体抑制剂MG132或3-MA处理CRC细胞，以进一步研究circinsig1-121介导的INSIG1降解的分子机制。

结果观察到MG132而不是3-MA提高了INSIG1的蛋白水平，并且在circINSIG1或circINSIG1-121过表达的CRC细胞中，INSIG1的泛素化水平升高，表明circINSIG1-121通过泛素-蛋白酶体途径促进了INSIG1的降解(图4E-F)。

固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)在哺乳动物胆固醇和脂质稳态中起着至关重要的作用。其中，SREBP1负责脂肪酸合成和能量储存，SREBP2负责胆固醇调节。据报道，INSIG1蛋白可与其互作。

因此，作者分析了全长SREBPs (fSREBPs)和核活性SREBPs (nSREBPs)的蛋白水平。Western blot分析显示，在过表达circINSIG1或circINSIG1-121的CRC细胞中，nSREBP2显著增加，但nSREBP1无显著变化，提示circINSIG1-121可能促进SREBP2激活，从而增强胆固醇的生物合成(图4G)。此外，对SREBP1和SREBP2靶基因进行分析，结果显示SREBP2靶基因表达水平升高，而SREBP1靶基因表达无明显变化(图4H)。与胆固醇生物合成基因的表达增强一致，与对照组相比，circINSIG1-121过表达增加了游离胆固醇含量(图4I)。

综上所述，这些数据表明circINSIG1-121促进了INSIG1的泛素依赖性降解，导致内质网释放SREBP2-SCAP复合物，随后诱导胆固醇的生物合成。

[if !supportLists]（5）[endif]circINSIG1-121招募CUL5-ASB6复合体促进与k48相关的INSIG1泛素化

为了确定导致INSIG1降解的泛素链类型，作者用不同的HA标记的泛素链载体转染CRC细胞。研究结果显示，INSIG1主要通过K48关联泛素化(图5A)。在circINSIG1-121过表达的细胞中，k48关联的多泛素化作用增强(图5B)。这些发现表明circINSIG1-121通过k48关联泛素化介导了INSIG1的降解。

那么，导致INSIG1降解的主要泛素化位点有哪些？

作者在INSIG1蛋白中鉴定出5个保守赖氨酸(K)点。将5个相应赖氨酸残基突变的INSIG1分别转染CRC细胞。结果发现与野生型组相比，转染INSIG1 K156R和K158R组的INSIG1蛋白水平略有下降(图5C-D)。

为了进一步证实INSIG1的这两个泛素化位点，构建了具有两个赖氨酸点突变的INSIG1突变体。western blot和免疫沉淀实验表明，该突变体显著减弱了circINSIG1-121介导的INSIG1降解，且INSIG1的k48关联泛素化水平显著低于野生型组(图5E和G)。这些结果表明，circINSIG1-121促进了INSIG1在K156和K158残基上的k48关联泛素化。

免疫沉淀实验验证了circINSIG1-121和泛素E3连接酶复合物（CUL5-ASB6复合物）之间的相互作用(图5H-I)。蛋白酶体抑制剂MG132和E3连接酶抑制剂MLN4924可导致内源性INSIG1蛋白水平明显升高(图5J)。

此外，ASB6过表达增强了与k48相关的INSIG1泛素化，降低了INSIG1蛋白的丰度(图5K)。相反，ASB6敲低增加了INSIG1蛋白的丰度，抑制了与k48相关的INSIG1泛素化(图5K)。此外，ASB6的过表达促进胆固醇的生物合成，反之亦然(图5L)。因此，circINSIG1-121招募CUL5-ASB6复合物，促进k48相关的INSIG1在K156和K158的泛素化。

[if !supportLists]（6）[endif]缺氧诱导的EIF4A3促进circINSIG1的表达

接下来，作者探讨了circINSIG1在结直肠癌细胞中的上调机制，如RNA结合蛋白。在circINSIG1反剪接位点的上游和下游分别鉴定出4个和6个EIF4A3结合位点(图6A)。Western blot和qRT-PCR检测显示，缺氧条件下EIF4A3蛋白表达上调，circINSIG1表达与EIF4A3表达呈正相关(图6B-C)。

RNA pull-down和RIP试验显示，EIF4A3可以结合circINSIG1的下游侧翼序列，但不能结合上游序列(图6D-E）。进一步构建了稳定过表达EIF4A3和一系列具有EIF4A3结合位点突变的circINSIG1小基因的CRC细胞系。单个结合位点的突变对circINSIG1的表达几乎没有影响，而所有六个EIF4A3结合位点的突变大大减少了circINSIG1的形成(图6G)。这些结果表明，这六个位于circINSIG1下游侧翼区域的eif4a3结合位点是eif4a3介导的circINSIG1环化所必需的。

此外，还观察到circINSIG1水平与EIF4A3呈正相关变化(图6H-I)。此外，EIF4A3的过表达促进了SREBP2靶基因的激活和胆固醇的生物合成，这可以通过沉默circINSIG1来部分减弱(图6J-L)。

总之，这些数据表明缺氧诱导的EIF4A3促进了circINSIG1的生物发生。

[if !supportLists]（7）[endif]circINSIG1是CRC患者的潜在治疗靶点

为了验证circINSIG1是否可以作为CRC的潜在治疗靶点，作者首先挑选了circINSIG1上调的PDX3和PDX6模型。并在这些模型中靶向circINSIG1检测其治疗效果。

结果显示，shcircINSIG1慢病毒治疗导致肿瘤生长明显低于对照组(图7A-B)。免疫组化分析显示，shcircINSIG1慢病毒治疗组的ki67阳性细胞百分比明显低于对照组(图7C)。

为了进一步验证circINSIG1在体内的作用机制，作者评估了circINSIG1下游靶点的表达并检测了这些肿瘤中的胆固醇含量。结果表明，敲低circINSIG1可降低circINSIG1-121的蛋白水平，抑制insig1介导的SREBP1信号传导(图7D-F)。此外，敲低circINSIG1的PDX肿瘤中游离胆固醇含量降低(图7G)。

综上所述，这些数据表明circINSIG1是CRC患者的一个新的治疗靶点。

研究结论

本研究结果表明：缺氧可诱导circINSIG1表达上调，circINSIG1的生物发生受EIF4A3调控。此外，circINSIG1编码一种新的蛋白circINSIG1-121，该蛋白募集CUL5-ASB6复合物，促进关键胆固醇代谢调节因子INSIG1 156和158处赖氨酸的k48关联泛素化，从而促进胆固醇生物合成和CRC进展。

值得注意的是，circINSIG1为缺氧和胆固醇代谢之间的交流提供了新的见解，并且是治疗结直肠癌的有希望的治疗靶点。

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