Adv Sci. | Ribo-seq技术助力挖掘胃癌的联合用药新策略

导读：

抗血管生成治疗是治疗实体癌的一种很有前途的策略。肿瘤细胞对缺氧的抵抗是抗血管生成治疗失败的主要原因，但其潜在机制尚不清楚。

本研究发现，ac4C通过促进糖酵解来增强胃癌细胞的缺氧耐受性。具体来说，乙酰转移酶NAT10的转录受HIF‐1α（细胞对缺氧反应的关键转录因子）的调控。此外，acRIP‐seq、核糖体分析（Ribo-seq）、RNA‐seq和功能研究证实，NAT10反过来通过介导SEPT9 mRNA ac4C修饰激活HIF‐1途径和随后的糖代谢重编程。NAT10/SEPT9/HIF‐1α正反馈回路的形成导致HIF‐1通路过度激活，诱导糖酵解。联合抗血管生成和ac4C抑制可减弱体内缺氧耐受性并抑制肿瘤进展。

本研究强调了ac4C在糖酵解调节中的关键作用，并提出通过阿帕替尼联合ac4C抑制来克服抗血管生成治疗的耐药性。

文章索引：

标题：N4-Acetylcytidine Drives Glycolysis Addiction in Gastric Cancer via NAT10/SEPT9/HIF-1α Positive Feedback Loop.

发表期刊：Adv Sci (Weinh).

发表时间：2023.08

作者团队：南方医科大学南方医院李国新教授团队

IF：15.1

DOI：10.1002/advs.202300898.

研究概览

研究结果

[if !supportLists]（1）[endif]低氧肿瘤微环境有助于胃癌中NAT10的上调

和已有研究一致，作者在免疫组织化学(IHC)分析中发现NAT10在肿瘤中心(CT)的表达高于浸润边缘(IM)(图1A)。并进一步通过免疫荧光(IF)检测了缺氧与人胃癌组织中NAT10表达的相关性，发现NAT10在缺氧的胃癌细胞中高度富集(图1B)。

阿帕替尼是一种用于晚期胃癌治疗的抑制剂，可诱导肿瘤内缺氧。阿帕替尼治疗后肿瘤血管生成显著减少(图1C)。同时在肿瘤中观察到明显的HIF‐1α积累，并且与邻近的非缺氧细胞相比，缺氧区域的GC细胞表现出NAT10表达增强(图1D)。

此外，用氯化钴(CoCl2)处理GC细胞，模拟体外缺氧条件。CoCl2以剂量依赖的方式增加细胞内HIF-1α和NAT10的水平(图1E)，这意味着细胞缺氧加剧促进了NAT10的表达。

进一步在Pscan网站(http://159.149.160.88/pscan/)上调节NAT10表达的重要转录因子。结果表明，HIF‐1α可能与NAT10启动子内的ACGTGC序列结合(图1F,G)。双荧光素酶实验显示，含有野生型NAT10启动子的荧光素酶质粒的转录活性随着CoCl2的增加而增强，而突变组无法诱导荧光素酶活性(图1H-I)。

总之，数据表明，低氧肿瘤微环境有助于胃癌中NAT10的上调，并且NAT10的转录受HIF‐1α的调节。

（2）ac4C促进GC细胞发生糖酵解表型的代谢重塑

为了研究mRNA ac4C修饰在GC中的功能，作者构建了NAT10稳定敲低的GC细胞系(AGS和MGC 80-3)(图2A)。NAT10下调导致总RNA ac4C水平显著下调(图2B)。

RNA‐seq分析表明NAT10反过来调节HIF‐1通路的活性。GSEA分析发现，在NAT10敲低的GC细胞中，HIF‐1途径和糖酵解被抑制(图2C)。差异基因表达分析和qPCR验证一致表明，HIF‐1途径中几种葡萄糖代谢关键酶在shNAT10细胞中下调，如己糖激酶(HK1、HK2和HKDC1)和丙酮酸脱氢酶激酶1 (PDK1)(图2D)。HK和PDK协同引导OXPHOS的碳通量进入糖酵解，驱动细胞代谢重编程和糖酵解依赖性。

代谢酶(HK1, HK2, HKDC1和PDK1)表达下调后，糖酵解减少，线粒体损伤减轻。用CoCl2处理的shNAT10细胞表现出显著降低的葡萄糖消耗、乳酸生成和ATP水平(图2E)。而对照细胞中线粒体去极化，线粒体膜电位(MMP)下降，线粒体功能障碍(图2F）。为了进一步研究代谢重编程对GC细胞的影响，作者利用Oligomycin A促进细胞糖酵解并阻碍OXPHOS过程。结果表明，糖酵解的增加促进了缺氧条件下GC细胞的增殖和迁移(图2G,H)。

综上所述，研究结果表明，NAT10参与调节糖代谢重编程，增强缺氧时糖酵解依赖性，以维持GC细胞的基本生物学功能。此外，HIF‐1α和NAT10之间可能存在反馈回路。

[if !supportLists]（3）[endif]SEPT9通过mRNA ac4C修饰调控糖代谢重编程

为了确定乙酰转移酶NAT10是否直接介导HK1、HK2、HKDC1和PDK1的mRNA ac4C修饰，作者进行了acRIP‐seq(图3A-D)。但分析显示，在NAT10沉默细胞和对照细胞之间，上述酶的mRNA ac4C峰没有显著差异，这表明NAT10介导的mRNA ac4C修饰可能间接调节这些酶的表达。

据报道，NAT10增强了mRNA的稳定性，而ac4C峰促进了翻译效率。因此，作者使用acRIP‐seq和Ribo‐seq组合来研究潜在的靶点。在shNAT10细胞中7个候选基因同时表现出mRNA乙酰化降低和翻译效率降低(图3E)。其中，SEPT9已知与HIF‐1α相关。因此，NAT10可能通过mRNA ac4C修饰上调SEPT9的表达，形成NAT10/SEPT9/HIF‐1α正反馈回路。

作者选择SEPT9作为ac4C代谢转移调控的候选靶点进行进一步研究。SEPT9沉默显著减弱GC细胞的糖酵解(图3F,G)。透射电镜显示，缺氧时GC细胞线粒体受损，对照组线粒体肿胀明显，而shSEPT9组线粒体损伤较小(图3H)。

这些发现支持了SEPT9是ac4C调节的糖酵解的下游效应分子的可能性。此外，NAT10/SEPT9/ HIF‐1α正反馈回路可能会在缺氧时触发HIF‐1信号的过度激活和糖酵解。

[if !supportLists]（4）[endif]ac4C调控SEPT9 mRNA的稳定性和翻译效率

ac4C修饰与SEPT9表达之间存在什么联系呢？

IF实验显示NAT10主要位于细胞核中，说明NAT10介导的mRNA ac4C修饰发生在细胞核中(图4A)。NAT10‐RIP和qPCR证实了SEPT9 mRNA上ac4c的富集(图4B)。Ribo‐seq和western blot证实，NAT10表达下调导致SEPT9的翻译效率和蛋白表达降低(图4C-D)。相反，过表达NAT10后，SEPT9蛋白表达恢复(图4E)。

ac4C修饰与SEPT9mRNA稳定性之间存在什么联系呢？

SEPT9 mRNA的半衰期约为16小时，ac4C信号减少伴随着SEPT9 mRNA的衰减增加(图4F)。acRIP‐seq数据显示，ac4C峰分布在SEPT9 mRNA的CDS区和3'UTR区(图4G)。然而，在shNAT10细胞中，3'UTR中ac4C峰的富集明显减少，提示该ac4C位点在调节SEPT9 mRNA稳定性方面可能更具动态作用。

作者将野生型或突变型SEPT9 3'UTR构建入萤火虫荧光素酶报告基因(图4H)。在突变体SEPT9 3'UTR的ac4C峰，胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)取代。双荧光素酶测定显示mut‐3'UTR组的荧光减弱，说明乙酰化丢失降低了mRNA稳定性(图4I)。

总的来说，NAT10通过ac4C修饰促进了SEPT9 mRNA的稳定性和翻译效率，3'UTR区域内的ac4C峰负责mRNA的稳定性。

[if !supportLists]（5）[endif]NAT10/SEPT9/HIF‐1α正反馈回路加剧GC细胞糖酵解

结构上，作者发现SEPT9与HIF‐1α通过GLY 78‐PHE 295和VAL 79‐THR 296等氨基酸残基位点形成氢键，表明SEPT9与HIF‐1α蛋白形成了稳定的蛋白对接模型。此外，Co-IP发现SEPT9与HIF‐1α存在相互作用(图5B)。

但是，在NAT10或SEPT9敲低的GC细胞中(用100µm CoCl2处理)，HIF‐1α的总蛋白水平没有显著降低(图5C)。这表明SEPT9可能存在促进HIF‐1通路激活的其他机制。

IF分析显示SEPT9在GC细胞核中大量积累(图5D)。据报道，SEPT9可能作为一种转运体影响HIF‐1α的细胞定位。因此，提取细胞核和细胞质蛋白来检测HIF‐1α的细胞分布。NAT10或SEPT9表达的下调伴随着核内HIF‐1α的降低。NAT10沉默且SEPT9过表达后核HIF‐1α恢复(图5E)。与代谢酶(HK1、HK2、HKDC1和PDK1)表达增加一致，shNAT10+SEPT9 GC细胞的糖酵解同步上调(图5F)。与对照细胞相比，缺氧状态下shNAT10+SEPT9 GC细胞线粒体功能障碍明显，形态肿胀，线粒体嵴缩短甚至缺失，部分线粒体出现局灶性空泡化或转化为小空泡化结构(图5G)。

此外，shNAT10+SEPT9 GC细胞在体内表现出更动态的增殖(图5H)。这些结果揭示了NAT10/SEPT9/ HIF‐1α在缺氧环境下形成一个驱动糖酵解的正反馈循环，以维持多种细胞活动的快速能量合成的新机制。

[if !supportLists]（6）[endif]ac4C抑制联合阿帕替尼可提高抗肿瘤疗效

抗血管生成治疗减少肿瘤血液供应，导致缺氧和酸性肿瘤微环境。而癌细胞可连接葡萄糖代谢以促进生存、增殖和长期维持。因此，作者假设通过抑制ac4C来降低GC细胞的缺氧耐受性，与抗血管生成治疗联合使用可能会提高治疗效果。

这种猜想在异种移植GC小鼠模型中得到了验证（图6）。因此，抗血管生成和抑制糖酵解的结合可能会降低肿瘤细胞的缺氧耐受性，从而阻止它们对微环境应激的反应。

总之，这些结果表明，将ac4C抑制与阿帕替尼联合使用是一种很有希望的抑制GC进展的治疗策略。

研究结论

本研究揭示了mRAN ac4C修饰与抗血管生成治疗耐药性之间的相关性，以及GC中NAT10过表达的新机制。此外，强调了NAT10/SEPT9/HIF-1α正反馈回路在糖酵解调节中的关键作用，并结合体外和体内证据证明靶向mRNA ac4C修饰可能是一种有希望的GC治疗策略。

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