Mol Cell. | Ribo-seq和Polysome profiling技术助力挖掘白血病中功能微肽

翻译起始是翻译过程中的限速步骤，其失调对包括造血恶性肿瘤在内的癌变至关重要。因此，发现新的翻译起始调节因子可能提供有希望的治疗靶点。

本研究结合Ribo-seq、质谱和RNA序列数据集，发现了急性髓性白血病(AML)中一种由非编码RNA转录物编码的肿瘤微肽APPLE(位于内质网)。APPLE在各种AML亚型中过表达，预后较差。该微肽在核糖体中富集，调节起始步骤以增强翻译并维持高的癌蛋白合成率。

机制上，APPLE促进PABPC1-eIF4G相互作用，促进mRNA循环和eIF4F起始复合物组装，以支持特定的促癌翻译程序。靶向APPLE在体外和体内均表现出广泛的抗癌作用。本研究不仅报道了微肽的未知功能，而且为靶向癌细胞翻译机制提供了新的契机。

文章索引：

标题：The oncomicropeptide APPLE promotes hematopoietic malignancy by enhancing translation initiation.

发表期刊：Molecular Cell

发表时间：2021.11

作者团队：中山大学生命科学学院陈月琴教授团队

IF：16

DOI：10.1016/j.molcel.2021.08.033.

研究概览

研究结果

（1）微肽APPLE的系统筛选与鉴定

为了鉴定lncRNAs sORF衍生的功能微肽，作者基于造血恶性肿瘤的Ribo-seq数据(GSE133925)和公开的质谱(MS)数据来筛选了具有编码潜力的lncRNAs。

首先定位了MS上鉴定的肽的染色体区域(图1A，蓝色)，然后重新分析了来自这些区域的lncRNA，再与核糖体结合lncRNA数据集(图1A，绿色)取交集(图1A，红色)。

具有以下特征的lncRNAs被认为可能具有编码能力：(1)在多聚体部分中富集，(2)异常表达，(3)在白血病中干扰其表达时具有功能相关性。结果，2828个lncRNA中有12个显示出潜在的高翻译能力(图1B)，12个lncRNA中有8个在髓系恶性肿瘤中有异常表达(图1C)，8个lncRNA中有6个在敲除后对恶性细胞增殖有显著影响(图1D)。

在这6个候选基因中，ASH1L-AS1敲低对细胞生长的抑制作用最为显著(图1D)。因此，本研究主要关注这种候选的微肽编码RNA。

首先，作者证实了这种微肽在细胞中的存在。通过将ASH1L-AS1的多个ORF衍生的潜在肽与质谱数据进行比对，ORF6被确定为可能翻译的ORF，由273 nt组成，编码90个氨基酸的微肽。另外，作者生成了一种针对ORF6肽的抗体。ORF6肽的敲低和过表达均证实了该抗体的特异性和该微肽的内源性表达(图1E-F)。最后，ORF6敲入(KI)通过免疫印迹、荧光和免疫沉淀(IP)后的质谱进一步证实了微肽的天然产生(图1G-K)。所有数据表明，ASH1L-AS1的ORF6编码一个真正的微肽。

亚细胞分离的结果显示该微肽在细胞质中有明显的分布(图1L)。值得注意的是，微肽主要与内质网标志物PDI共定位(图1M)。因此，将该肽命名为APPLE。核糖体分离和免疫荧光显示，APPLE在核糖体结合的ER中富集(图1N)。

（2）编码APPLE的AHS1L-AS1的高表达与造血恶性肿瘤的不良预后相关

为了探究APPLE是否在AML发展中起作用，分析了其编码转录物的表达模式。分析TCGA数据和多AML亚型微阵列数据集(GSE13204)可发现APPLE在AML中具有广泛的调节作用。作者在一组患者样本进行了验证。结果显示，诊断时患者组(n = 46)的ASH1L-AS1表达高于健康者组(n = 12)或完全缓解(CR)组(n = 19)(图2A)。患者样本中APPLE蛋白水平升高(图2B和2C)。这些数据表明APPLE的表达与临床预后密切相关。

然后，作者评估异常表达APPLE编码的ASH1L-AS1的临床价值（图2D-F）。

综上所述，ASH1L-AS1的高表达可能是一个关键的危险因素，其编码的APPLE可能在AML中起关键作用。

（3）APPLE作为一种广谱肿瘤微肽，在体内和体外维持肿瘤的发展

上调的APPLE是否在白血病发生中发挥重要作用呢？

体外实验中，各AML亚型(M2-M5)细胞系中，APPLE的沉默显示出了显著的抗白血病作用，包括抑制增殖、细胞周期进展和促进细胞凋亡(图3A-B)，这表明靶定APPLE具有广谱的抗癌作用。

此外，APPLE敲低克服了NB4和MOLM-13的细胞分化阻断，导致了自我更新能力受损(图3C-3E)。相比之下，在MOLM-13中，APPLE过表达导致了与APPLE敲低相反的表型，这表明APPLE具有促癌作用(图3F-3H)。APPLE的致癌作用在AML患者样本的原代细胞中得到进一步证实(图3J）。

体内实验中，苏木精和伊红(H&E)染色显示，APPLE敲低导致NOD-SCID小鼠的白血病细胞浸润能力下降，肝损伤减轻(图3K)。骨髓(BM)、外周血及脾、肝等脏器中hCD45+细胞的减少(图3L)表明，浸润能力下降与肿瘤负荷减轻一致。值得注意的是，APPLE耗竭后，BM白血病细胞的特征性分化阻滞明显减轻(图3M)。

相比之下，APPLE而非APPLE mut过表达促进了白血病细胞的浸润和分化阻断(图3N-O)，这表明APPLE蛋白参与了致瘤作用。与此一致的是，APPLE缺失组小鼠的生存时间延长(图3P)， APPLE而不是APPLE mut过表达加速了癌症的进展(图3Q)。综上所述，这些数据表明APPLE是肿瘤发生过程中必不可少的肿瘤微肽，靶向APPLE可产生广谱的抗癌作用。

（4）肿瘤微肽APPLE促进mRNA翻译

为了研究APPLE如何促进AML进展，作者进行了Co-IP来确定APPLE的互作组。SDS-PAGE分离co-IP样品后进行MS分析(图4A)。GO分析显示，APPLE的交互组最丰富的是与“翻译”相关的类别(图4B)。因此推测APPLE可能在翻译过程中起作用。

为了验证这一推测，作者在AML细胞中敲除了APPLE后，进行了SUnSET试验(图4C)。APPLE敲低导致所有AML细胞系整体蛋白合成下降(图4D)，这可以通过过表达APPLE而不是APPLEmut来挽救(图4E)。

此外，APPLE缺失导致显著的多聚核糖体图谱变化（Polysome profiling分析），降低了多聚体/单体(P/M)比率，而APPLE过表达导致P/M比率升高(图4F-4H)。这些数据表明，APPLE主要通过调控起始步骤来促进翻译。

作者还使用Harringtonine做了进一步验证，它可以抑制翻译起始而不影响AML细胞中的延伸核糖体。在Harringtonine处理下，APPLE耗损后蛋白质合成的减少在很大程度上减少，支持APPLE在翻译起始中的主要调节作用(图S5G)。

当在MOLM-13中加入EDTA解离成熟的80S核糖体(图4I)时，APPLE主要富集于游离RNP和60S核糖体部分(图4J)，这表明APPLE可能通过与RNA结合蛋白或核糖体大亚基相互作用来调节翻译。

（5）APPLE增强了PABPC1- eIF4G的相互作用

在已鉴定的APPLE互作物中，PABPC1得分最高(图5A)。NB4和293T的Co-IP和免疫荧光显示APPLE确实与PABPC1相互作用(图5B-5D)。此外，RNase A的处理对它们之间的相互作用没有影响，表明其对RNA的独立性(图5E)。

PABPC1是翻译起始的关键参与者。它在翻译起始中的主要作用是通过与eIF4F-m7G帽结合复合物的支架分子eIF4G相互作用介导mRNA循环化。那APPLE是否参与了这个过程呢？

在NB4、MV4-11和293T细胞中证实了APPLE与eIF4G的相互作用(图5F-G)。值得注意的是，APPLE缺失显著降低了PABPC1-eIF4G相互作用(图5H)。在AML和293T细胞中，APPLE异位表达而不是APPLE mut恢复了这种作用(图5I)。体外Pull-down进一步证实了APPLE直接与PABPC1和eIF4G的n端结构域(eIF4GNt)结合(图5J-K)。APPLE可以促进PABPC1-eIF4GNt相互作用，并且结合亲和力以浓度依赖的方式增加(图5L)，说明APPLE可增强这种相互作用。

（6）APPLE通过结合PABPC1的RRM1和RRM3结构域促进mRNA循环和翻译起始

据报道，eIF4G可以直接结合到PABPC1的RRM2结构域，其侧面结构域RRM1或RRM3也是它们相互作用所必需的。作者发现删除RRM1或RRM3结构域会显著削弱了PABPC1-APPLE相互作用(图6A-B)。

此外，当RRM1和RRM3都被删除时，APPLE-PABPC1的相互作用被完全取消(图6C)，而包含RRM1或RRM3的域组合仍然保留其相互作用(图6D)。这些数据表明，RRM1和RRM3对APPLE-PABPC1相互作用都很重要。

因此，作者提出APPLE是PABPC1-eIF4G复合体的新成员，并通过绑定RRM1和RRM3来增强其相互作用，起到“铆钉”的作用(图6E)。

接下来，作者进行了MS2 tethering assays，以评估APPLE对mRNA循环化的影响(图6F)。结果显示：当APPLE连接到报告基因mRNA的3′UTR上时，翻译效率提高(图6G)，表明APPLE促进了mRNA的循环化。此外，由于mRNA循环化刺激了eIF4F复合物(eIF4G/4A/4E)的组装以促进翻译起始，作者随后验证了APPLE对eIF4F复合物组装的影响(图6H)。

APPLE-KO在很大程度上消除了PABPC1、eIF4G和eIF4A与m7G帽的结合，而APPLE的异位表达而不是APPLEmut的异位表达挽救了APPLE-KO NB4和293T中受阻的eIF4F组装(图6I)，证实了APPLE在mRNA循环化和翻译起始中的作用。此外，敲低PABPC1或eIF4G在很大程度上削弱了APPLE对AML细胞中全局蛋白合成的促进作用，这意味着mRNA环化负责APPLE介导的翻译调节(图6J)。

综上所述，这些数据表明APPLE在翻译促进中的作用是作为翻译起始复合物的新组分，促进mRNA的循环化和eIF4F的组装。

（7）APPLE调节促进AML进展的特定mRNA子集的翻译

翻译机器的不同组成部分会改变参与肿瘤进展的mRNA的选择性翻译。因此，作者最后研究了APPLE调控哪些特定的mRNA亚群以及APPLE如何“翻译”AML。

作者对照和APPLE-KO的MOLM-13细胞进行了Ribo-seq和RNA-seq。样本共检测到14099个具有三碱基密码子周期性模式的RNA转录本，其中大多数reads来自CDS区域(图7A)。和转录组联合分析发现了一组mrna的翻译效率在APPLE敲低时发生了显著变化(图7B)。而且，这些基因的起始密码子处的read分布显著增加(图7C-D)，支持上述APPLE在翻译起始中的正调控作用。对这些基因的GO分析表明，APPLE调控的靶点主要参与细胞分化、生长和死亡，这对肿瘤的发展至关重要(图7E)，这表明APPLE在重要的促癌程序中发挥了作用。

作者选择了几个与细胞存活相关的候选基因。这些候选基因转录本上核糖体密度显著降低，而它们的mRNA水平则不受APPLE敲除的影响(图7F)。这些靶点在APPLE-KO MOLM-13和原代患者细胞中进一步验证(图7G)。多聚体/亚多聚体比率显示的翻译效率也证实了这些靶点在APPLE敲低后的翻译抑制作用(图S7G)。

值得注意的是，异位表达APPLE而不是APPLEmut可以挽救APPLE敲低对特定靶点的影响，APPLE过表达进一步增加了MOLM-13中靶点的蛋白水平(图7H)。这表明特定靶点的翻译变化依赖于APPLE。

为了进一步研究候选靶点的作用，作者选择了PIM1和KRAS进行验证。PIM1或KRAS的异位表达可以部分恢复APPLE敲低对MOLM-13分化和诱导凋亡的抗癌作用，这表明这些靶点对APPLE依赖性的致癌活性很重要(图7I-J)。

总之，本研究发现了一种真正的微肽APPLE，它是翻译机制的一种新型刺激物，对于维持肿瘤发生过程中的高翻译需求至关重要。如图7K所示，AML细胞中高表达的APPLE可增强PABPC1-eIF4G相互作用，促进翻译启动，进而支持促癌翻译程序。

研究结论

本研究揭示了：

一个由非编码RNA转录物编码的肿瘤微肽APPLE；

APPLE调节翻译起始以支持选择性癌蛋白合成；

APPLE促进PABPC1-eIF4G相互作用、mRNA环和eIF4F复合物组装；

靶向APPLE在体外和体内均表现出广泛的抗癌作用。

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