Nucleic Acids Res. | Polysome profiling和Ribo-seq助力挖掘神经退行性疾病中功能分子

导读：

RNA结合蛋白TDP-43与神经退行性疾病密切相关。动物和细胞模型显示TDP-43介导的RNA调节会导致肌萎缩侧索硬化和额颞叶痴呆。然而，潜在的机制仍未然未知。

本研究阐释了运动神经元样细胞和皮层神经元原代培养物中过表达人TDP-43和TDP-43A315T突变蛋白对翻译的影响。在运动神经元样细胞中，TDP-43与核糖体结合而不显著影响全局翻译（Polysome Profiling分析）。然而，核糖体分析（Ribo-seq）显示Camta1、Mig12和Dennd4a mRNA的翻译增强。过表达野生型TDP-43或TDP-43A315T均可刺激Camta1和Mig12 mRNA的翻译，并增加Camta1和Mig12蛋白水平；Dennd4a mRNA的翻译增强则需要特定的3'UTR区域。这些数据显示，TDP-43可以作为mRNA特异性翻译增强子发挥作用。

文章索引：

标题：TDP-43 enhances translation of specific mRNAs linked to neurodegenerative disease.

发表期刊：Nucleic Acids Research 

发表时间：2019.01

作者团队：德国汉堡-埃彭多夫大学医学中心(UKE) Kent E Duncan团队

IF：14.9

DOI：10.1093/nar/gky972.

研究概览

研究结果

（1）TDP-43可以与细胞中的活跃翻译的多核糖体结合

据报道，在细胞急性应激过程中，TDP-43与核糖体相关，导致大多数mRNA的翻译大量减少。那TDP-43是否与活跃翻译细胞中的核糖体-mRNA复合物也存在相互作用呢？

作者首先对运动神经元样细胞系MN1进行了Polysome profiling分析及WB检测。结果检测到TDP-43-V5与大核糖体亚基蛋白L7A均分布在Heavy-polysome组分中(图1A)。

在离心前用Mg2+螯合剂EDTA处理裂解物，多聚体完全解聚，核糖体蛋白L7A和TDP-43- v5信号也转移到了较轻组分中（图1B）。

其次，作者还采用了核糖体亲和纯化技术(TRAP)检测TDP-43是否与核糖体共沉淀。结果显示：GFP-L10a能观察到大核糖体亚基蛋白L7A的免疫共沉淀(图1C)。同样，内源性TDP-43和转染的TDP-43-v5都与GFP-L10a特异性相互作用，但不单独与GFP相互作用(图1D-E)。

综合来看，Polysome profiling和TRAP分析结果表明：在没有细胞应激的情况下，当翻译活跃发生时，部分TDP-43蛋白会与核糖体-mRNA复合物结合。

（2）人TDP-43或TDP-43A315T蛋白过表达对一般翻译没有显著影响

TDP-43在主动翻译细胞中与核糖体的关联提示其在翻译调控中具有潜在的作用。那这种关联是普遍的，还是mRNA特异性的呢？

作者测试了过表达人TDP-43 (hTDP-43)或突变蛋白(hTDP-43A315T)是否会影响运动神经元样细胞的一般翻译。Polysome profiling分析表明TDP-43过表达对一般翻译没有显著影响(图1F-I)。

（3）核糖体分析揭示了MN1细胞和原代神经元中TDP-43的潜在翻译靶点

为了在翻译水平上鉴定由TDP-43调控的特异性mRNA，作者对运动神经元样MN1细胞和原代皮层神经元培养物进行了核糖体分析(Ribo-seq，图2A)。核糖体足迹显著改变的基因如图2B-C。并进一步确定了四个基因进行下游分析：Camta1、Dennd4a、Pth1r和Mig12/Mid1ip1。

（4）Polysome profiling分析证实了hTDP-43A315T蛋白增加了MN1细胞中Camta1、Mig12和Dennd4a mRNA上的核糖体密度

基于上述Ribo-seq的结果，作者采用Polysome profiling和qPCR的方法进行了验证。结果显示：当hTDP-43A315T蛋白表达时，Camta1, Mig12和Dennd4a mRNA都转移到更重的组分中(图3A-D)，这意味着这些mRNA上的核糖体密度增加。而GAPDH mRNA在多聚体中的分布则不受hTDP43A315T的影响(图3E)。

综上所述，外源表达hTDP-43A315T蛋白会增加Camta1、Mig12和Dennd4a mRNA上的核糖体密度，从而影响它们在运动神经元样细胞中的翻译。

（5）TDP-43蛋白直接与Camta1、Mig12和Dennd4A mRNA相互作用

随后，作者采用UV-CLIP技术确定了在运动神经元样MN1细胞中，TDP-43蛋白直接与Camta1、Mig12和Dennd4a mRNA相互作用(图4)。

（6）荧光素酶报告基因分析揭示了WT和突变体TDP-43对翻译调控的重要mRNA区域

进一步地，作者通过报告基因系统确定了hTDP-43和hTDP-43A315T通过与Camta1和Mig12 mRNA的5'UTR作用，增强它们的翻译；而hTDP-43A315T通过作用于3'UTR区域的机制增强Dennd4a mRNA的翻译（图5）。

（7）hTDP-43过表达导致MN1细胞中CAMTA1和MIG12蛋白水平升高

与前结果一致的是，转染hTDP-43 WT或hTDP-43A315T蛋白的细胞中CAMTA1和MIG12蛋白水平升高(图6)。这些数据表明，TDP-43水平的增加可以提高其直接结合的两个翻译靶标编码的蛋白质水平。

（8）hTDP-43A315T表达导致初级皮层神经元中MIG12蛋白水平升高

作者接下来研究了hTDP-43突变体表达对原代皮质神经元中MIG12蛋白水平的影响。结果显示：与非转基因WT细胞相比，表达hTDP-43A315T蛋白的细胞的神经突中MIG12蛋白水平显著增加。免疫染色数据显示，皮层神经元原代培养中，hTDP-43A315T蛋白也会影响MIG12蛋白水平。

（9）MID1可修饰TDP-43对MIG12蛋白的作用

与CAMTA1和DENND4a不同，MIG12与神经退行性疾病之间没有直接联系。据报道，MIG12的互作蛋白-MID1在神经发育障碍和神经退行性疾病中发挥作用。胞质蛋白MID1，其分子功能包括E3泛素连接酶活性和翻译调节。这表明MID1与MIG12结合可能影响MIG12蛋白水平，这也可能是MIG12 mRNA翻译与神经退行性疾病之间的潜在联系。

作者用hTDP-43或hTDP-43A315T转染MN1细胞，同时共转染pcDNA3空载或myc-GFP-MID1(图8A-B)。

当共转染pcDNA3空载体时，hTDP-43或hTDP-43A315T驱动蛋白水平升高(图8A和C)。

当共转染pcDNA3-myc-GFP-MID1时，完全消除了TDP-43对细胞核MIG12水平的影响(图8B和C)。当pCDNA3.1或myc-GFP-MID1质粒共转染时，hTDP-43或hTDP-43A315T不影响细胞质MIG12水平(图8D)。因此，过表达MID1可以减轻过表达hTDP-43蛋白对MN1细胞中MIG12蛋白水平的影响。

研究结论

本研究确定了TDP-43作为mRNA特异性翻译增强子的新功能。在运动神经元样细胞中，TDP-43过表达可以通过Camta1和Mig12 mRNA的5 'UTR机制增强其翻译。相反，Dennd4a mRNA的翻译增强则通过3'UTR发生，并被TDP-43等位基因突变选择性触发，导致患者患病。本研究结果有助于阐明RNA结合蛋白的翻译调控，并提出TDP-43的mRNA特异性翻译增强子功能与神经退行性疾病有关的可能性。