宏基因组（mNGS）简介（一）——临床领域的应用场景

迄今为止，临床宏基因组学的应用场景包括以下几个方面：1、各种综合征和样本类型的传染病诊断 2、患病和健康状态下的微生物组特征分析 3、宿主转录学分析确定人类宿主对感染的反应特征 4、 肿瘤领域的应用包括鉴定肿瘤相关病毒及鉴定基因组整合位点。除传染病诊断外，mNGS其它领域的应用速度一直很慢，大多数应用尚未纳入常规临床实践。尽管如此，这些应用很可能在不久的将来改变诊断微生物学的领域。

（1） 传染性疾病的诊断

分子诊断分析为诊断最常见的感染提供了一种快速经济有效的方法(通常小于2小时的周转时间)。然而，目前使用的几乎所有常规微生物试验一次只能检测一种或有限的病原体，或要求从临床样本中成功培养出微生物。与之相比，NGS的方法虽然耗费时间较长（在标准Illumina测序仪上需要耗费大于18个小时的时间），但是mNGS可以根据各个物种唯一的DNA或者RNA序列，一次性检测范围较广的病原菌，包括病毒、细菌、真菌或者寄生虫。因此，NGS在诊断中的临床应用可能是在最难诊断的病例或免疫功能低下的患者中，在这些患者中潜在病原体的范围更大。最终，mNGS方法与其他多种检测方法相比更具成本竞争力，可以用作排除感染性病因的预先检测方法。当然，核酸类型的检测，无论是通过多重PCR 还是NGS，都不能单独证明一种是感染的病因，发现的结果必须在临床背景下进行解释。在临床样本中发现非典型或新型感染源时，需要进行后续的确认调查工作，例如组织活检样本的正交试验和血清试验，或者通过细胞培养以及动物模型的方法，以确定真正的致病菌。

图1 A 在传染病诊断方面的应用。包括从主要临床样本中直接鉴定微生物(Aa部分);基于耐药基因鉴定的抗菌药物耐药性预测(Ab部分)；检测种级或株级毒力决定因素，如分泌特定内毒素或外毒素(Ac部分);抗病毒药物耐药性预测(Ad部分)。如HIV-1所示，通过宏基因组下一代测序(mNGS)(部分Ad，图)从患者样本中恢复完整的病毒基因组有助于序列分析，以预测抗逆转录病毒药物的敏感性或耐药性(部分Ad，柱状图);分析菌株的易感谱(黑条)预测了对非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)类药物的耐药性(用星号表示)，而不是核苷逆转录酶抑制剂(NRTIs)或蛋白酶抑制剂(pi)

（2） 临床微生物组分析

许多研究人员现在使用mNGS或16S rRNA基因靶向测序来深入描述微生物群落。越来越多的人意识到微生物组及其在急性和慢性疾病状态中的可能作用。然而，基于微生物组的测试还没有被临床验证用于疾病的诊断或治疗，部分原因是由于对微生物组的复杂性及其在疾病发病机制中的作用的认识还不完全。
以下是临床微生物组分析的两个应用：
1、微生物组分析的一个未来临床应用可能是艰难梭菌相关疾病的管理和治疗。艰难梭菌是一种机会性细菌，可感染肠道，导致产生毒素，可导致腹泻、脱水、败血症和死亡。艰难梭菌感染只发生在受广谱抗生素或胃肠道手术等因素影响而改变的微生物组环境中。粪便移植在治疗可以治愈80% - 90%艰难梭菌感染中，这也证明了微生物组的重要性。在多项研究中使用mNGS来表征微生物组，促进了细菌-益生菌混合物的开发，这些混合物可作为预防或治疗艰难梭菌相关疾病的药片使用。
2、微生物组的另一个潜在应用是分析细菌多样性，这可以为患者的疾病是传染性还是非传染性提供线索。例如，一项用于鉴定肺炎患者呼吸道病原体的mNGS研究发现，经培养证实感染的个体其呼吸道微生物组的多样性明显较低。微生物组的改变，称为生态失调，它通常与肥胖、糖尿病、炎症性肠病等疾病相关，而微生物组的调控可能是治疗这些病理条件的途径。

图1 B 微生物组分析可以告知疾病、预后在急性和慢性疾病状态。彩色条代表微生物群的类别。生物失调(一种不健康的状态)可以看到物种多样性的减少，例如难辨梭菌相关疾病患者的情况。健康个体的粪便可以通过粪便移植或口服包囊粪丸来治疗艰难梭菌感染患者。另外，健康个体微生物群产生的合成粪便也可以作为益生菌用于治疗患者。除了艰难梭菌感染，慢性疾病，如肥胖，炎症性肠病和糖尿病是益生菌治疗的潜在靶点

（3） 人体宿主反应分析

临床mNGS主要关注微生物reads，然而RNA病毒检测的mNGS测序恰巧可以产生宿主RNA-seq分析数据，研究人类宿主感染时的基因表达对病菌感染具有补充作用。
尽管迄今为止没有任何基于RNA-seq的检测方法被临床验证用于患者，但RNA序列分析的潜在价值非常高。通过对微生物中具有转录活性的RNA序列分析，可以区分感染与定殖、活菌与死菌。此外，对人类宿主的RNAseq分析可用于直接从临床样本中识别新的或未得到充分重视的宿主微生物相互作用，正如莱姆病、登革热或疟疾患者中所显示的那样。RNA-seq分析可能在未来临床应用中具有特别重要的作用，因为真正起作用的病原菌在转录组中是短暂存在的。与血清学检测类似，感染的间接诊断也可能基于病原体特异性的人类宿主反应。。随着大规模测序数据的不断产生，或许是由常规临床mNGS检测驱动的，对人类reads的二次挖掘可能通过整合微生物和宿主基因表达数据提高临床诊断的准确性。

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图1 C 基于RNA-seq分析可以在人类宿主反应的基础上提高传染性和非传染性条件的诊断。NGS的宿主转录组分析可以构建分类器度量，以区分感染患者(红条)和未感染患者(蓝条)，具有较高的准确性(Ca部分)。虚线以上的度量分数表示感染，而虚线以下的分数表示没有感染;所示分类器度量的总体精度为83%。聚类热图分析确定个体差异表达的宿主基因与感染相关(基因A F)与未感染相关(基因G L)(部分Cb)。

（4）mNGS在肿瘤领域的应用

在肿瘤领域，全基因组测序或Panel捕获的NGS方法可用于同时发现与癌症相关的病毒(即疱疹病毒、乳头瘤病毒和多瘤病毒)或收集病毒与宿主相互作用的数据。例如，mNGS在发现默克尔细胞多瘤病毒(图1D)中起关键作用，默克尔细胞癌是一种最常见于老年患者的罕见皮肤癌，默克尔细胞多瘤病毒现在认为是默克尔细胞癌的原因。迄今为止，美国食品和药物管理局(FDA)已经批准了两种NGS Panel（MSK,Foundation One）检测基因突变。通过在Panel上添加特定的病毒探针，可以对整个肿瘤基因组或外显子组进行测序时，顺便完成这些样本中整合病毒和外源性病毒的检测。

图1 D 在肿瘤学中，病毒肿瘤的测序或液体活检分析可以同时用于病原体检测和宿主基因突变分析。mNGS可用于检测默克尔细胞多瘤病毒，这种病毒与默克尔细胞癌的发展相关。宿主DNA的同步测序可以识别由包含全长大T抗原(LT)的病毒基因组整合后随之截断(Da部分)或LT抗原在病毒基因组整合前截断(Db部分)引起的突变。这两种突变都会导致细胞转化，从而驱动肿瘤增殖。尽管前景看好，但许多基于测序的应用尚未纳入常规临床实践

参考文献：

[1] Chiu C Y , Miller S A . Clinical metagenomics[J]. Nature Reviews Genetics, 2019.