【Cell】空转Visium与CODEX的强强联合发现胶质母细胞瘤具有多层结构

早先的研究通过scRNA-seq分析了GBM内的不同细胞成分，定义了三种主要的恶性细胞状态，以及不同GBM亚型的GBM免疫细胞的情况。但缺乏在GBM生态系统中对这些已定义的细胞成分进行原位空间映射。

空间多组学的发展使研究人员能够对细胞类型和细胞状态进行精细的原位空间映射。2024年4月22号，来自以色列魏茨曼科学研究所的Itay Tirosh教授团队通过空转 10x Visium （19个GBM样本）和空间蛋白组CODEX（12个GBM样本）对GBM开展了全面和深度的空间原位分析，揭示了GBM由结构化区域和无序区域组成；结构化区域包含了与缺氧相关的五个层次的组织结构；发现了经典组织病理学无法识别的区域特征。

研究结果“Integrative spatial analysis reveals a multi-layered organization of glioblastoma”发表在顶刊《Cell》上。

01 胶质瘤的空间转录组学

研究人员分析了13个GBM切片和6个IDH突变的胶质瘤切片。将这些样本与public的Visium数据集的13个GBM切片整合在一起。首先，通过平均每个染色体区域的基因表达来进行拷贝数偏差(CNA)推断，将spot归类为主要恶性、大部分非恶性或混合。推测CNA包括GBM和少突胶质瘤的特征，并与癌症丰富的区域显著相关。

其次，在有多个切片的病例中，通过每个样本和每个肿瘤联合的Leiden聚类来聚类spot，并通过基因集浓缩分析来注释聚类。

02 GBM表达异质性的重复模式

为了定义反映表达异质性核心模式的表达程序，比较了通过Leiden聚类或 NMF在单个GBM样本中识别的492个基因表达程序。研究人员发现了显著的相似性，随后根据基因重叠定义了14个MP，每50个基因称为元程序（metaprogram，MP），8 个恶性MP和6个非恶性MP。

非恶性MP包括Mac（巨噬细胞/小胶质细胞）和Inflammatory-Mac（炎性巨噬细胞/中性粒细胞）、Oligo（少突胶质细胞）、Vasc（内皮细胞和周细胞）、Neuron和Reactive-Ast（反应性星形胶质细胞）。

在八种恶性MP中，五种直接映射到单细胞GBM状态：MES缺氧(MES2)、MES (MES1)、NPC样、OPC样和AC样。神经发育相关的恶性MP（NPC样、OPC样和AC样）与相应非恶性细胞类型特征的特征具有高度基因重叠。另外三种恶性空间 MP 包括：（1）星形细胞样间充质MP（MES-Ast），富含与神经胶质瘤肿瘤微管相关的基因；（2）增殖和代谢(Prolif-Metab)，富含增殖相关基因和代谢基因；（3）染色质调节(Chromatin-Reg)，富含染色质和转录调节因子以及NPC相关基因。 

03 CODEX构建GBM空间单细胞图谱

虽然 Visium 通过覆盖大多数基因提供全面的数据，但它的空间分辨率较低，不能捕获稀有或空间分散的细胞类型和细胞状态。比如研究人员并没有发现细胞周期相关的MP，这就提出了一种可能性：即在大多数情况下，一个处在周期活跃的细胞被很多其他类型的细胞所包围，从而稀释了细胞周期信号。同样，T细胞和B细胞很少在一个spot中占主导地位，它们的低mRNA含量进一步限制了它们的信号，因此研究人员无法通过无监督分析识别T细胞或B细胞相关的MP。为更完整的构建GBM的空间结构，研究人员通过CODEX（40个抗体panel）鉴定了所有主要分化的非恶性细胞类型和主要的恶性细胞状态，包括了占比较低的T细胞和B细胞。

04 Visium和CODEX的联合分析

为了能够直接比较CODEX和Visium数据，研究人员使用STalign对两个数据集进行空间对齐，然后将CODEX数据从单个细胞转换为与Visium相当的pseudospots，并将这些数据分配给MP。使用单细胞CODEX数据能够检查 Visium大小的pseudospots内细胞的完整组成，还能够评估每个状态的细胞密度，使研究人员获得了高分辨率下的细胞类型关系以及对应的基因表达特征。

05 Visium和CODEX联合构建完整的GBM空间图谱

研究人员分析了Visium定义的MP的邻近关系以及对应的CODEX定义的细胞类型的邻近空间关系。通过分析同一个MP的邻近的MP数量，GBM组织空间可以分为结构化区域和无序区域。进一步发现了结构化区域中占比最多的是缺氧性的恶性细胞（MES-Hyp），说明了缺氧是GBM有序结构组织的驱动因素。

接下来研究人员分析了不同区域大小和分辨率下的细胞类型的互作关系。发现了区域越大，结构化和无序两类区域中细胞互作的频率相似，但是在更低分辨率下，结构化的区域中细胞互作的频率显著高于无序的区域。在结构化的恶性细胞区域，巨噬细胞与MES-Hyp恶性细胞显著互作，而T细胞与MES-Ast恶性细胞显著互作。说明了结构化区域和无序区域在空间高分辨率下存在显著差异的细胞互作关系。

06 空间多组学揭示新的病理组织学特征

研究人员整合分析了每个样本中上述的细胞互作关系，构建了结构化区域的样本的空间组成层次，发现了与缺氧相关的5个层次结构，包括：

L1: core hypoxia/necrosis；L2: hypoxia-associated；L3: angiogenic response/immune hub；L4: malignant neurodevelopmental states；L5: brain parenchyma

每个层中都含有特征性的细胞类型及互作关系网络。特别是发现了其中的L1、L3、L4和L5可以对应到经典的组织病理学分类特征上。但值得注意的是，经典组织病理学或 IVY Gap 转录程序无法区分缺氧相邻层 (L2) 和局部缺氧的小区域，L2 不直接映射到组织病理学特征。因此空间单细胞分辨率上对细胞状态的分析重新定义了经典的组织病理学特征。

总结讨论

此项研究结合空间转录组学10x Visium、空间单细胞蛋白组CODEX定义了胶质瘤细胞状态并揭示了它们的组织空间关系。由于Visium的分辨率有限，以前的研究只能定义空间邻域，通常代表细胞状态和细胞类型的混合体，从空间转录组学中解析单个细胞状态和细胞类型仍然具有挑战性。为了弥补这些局限性，研究人员对邻近的组织切片进行了CODEX分析，使研究人员能够检测到低丰度的细胞类型，并以单细胞分辨率揭示Visium spot的组成。总之，这项研究对胶质瘤进行了深度的空间描述，在多个尺度上刻画了空间细胞组织，这为我们对胶质瘤微环境生态位的理解增加了一个空间维度，并可能有助于未来治疗方法的发展。

[参考文献]Greenwald AC, Darnell NG, Hoefflin R, et al. Integrative spatial analysis reveals a multi-layered organization of glioblastoma. Cell. 2024 Apr 16:S0092-8674(24)00320-9.