最新11.1分生信，单细胞+实验的经典思路，通过单细胞鉴定特定亚群，再结合实验验证！

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研究概述：肿瘤浸润B细胞的广泛参与突显了它们在肿瘤行为中的潜在作用。然而，胰腺导管腺癌（PDAC）中B细胞的异质性仍未得到探索。研究PDAC中的TIL-Bs旨在确定新的治疗策略。作者在FUSCC和TCGA队列中探讨了CD38+B细胞的预后和免疫学价值，并通过流式细胞术研究了CD38+B细胞与其他免疫细胞之间的关系及其表型特征。最后进行了体外和体内实验，以评估CD38+B细胞对抗肿瘤免疫的潜在影响。作者发现调节性B细胞样CD38+B细胞浸润是PDAC的一个独立预后因素，使用CD38抑制剂可能为PDAC免疫疗法提供新的可能性。
研究结果：

通过scRNA-seq鉴定B细胞集群

TIL-Bs是抗肿瘤免疫应答的多方面参与者。然而，TIL-Bs在肿瘤免疫调节中的具体作用仍不清楚，这表明需要进一步探索TIL-Bs参与癌症的复杂性，并对治疗干预的潜在影响进行更深入的研究。为了进一步描述PDAC患者TME中B细胞系的多样性，作者对从两名PDAC患者的胰腺手术标本中获得的FACS纯化的CD45+CD19+B细胞进行了scRNA-seq分析（图1A和B）。经过质量控制后，PCA鉴定了24,089个B细胞中的差异表达基因，从而确定了三个B细胞主簇（图1C）。通过对每个细胞集群的差异基因表达分析，确定了集群特异性标记基因（图1D）。

为了评估所鉴定的B细胞集群的合理性并确定其临床意义，作者利用了外部验证队列（CRA001160）。排除肿瘤细胞后，确定了由B细胞、T细胞、内皮细胞、骨髓细胞和成纤维细胞组成的五个细胞群（图1E和F）。在这个独立的数据集中，BANK1+、CD38+和SSR4+B细胞也被区分开来（图1G和H）。正如预期的那样，与正常组织相比，在肿瘤中观察到的B细胞数量有所增加（图1G），三种主要B细胞群在患者中的分布也不尽相同（图1I）。值得注意的是，CD38+B细胞丰富的肿瘤患者表现出更差的分化状态、更高的病理TNM分期、更高的CA19-9浓度和更多的血管侵犯（图1J）。总之，作者在两个独立的PDACscRNA-seq数据集中发现了三个主要的B细胞群，并强调了CD38+CD19+B细胞与患者不良预后的潜在关联。

CD38+CD19+B细胞在PDAC中的存在

为了进一步研究CD38+CD19+B细胞的存在及其临床相关性，作者对来自FUSCC队列的147例PDAC和45例肿瘤周围样本的FFPE切片进行了多重免疫染色（图2A）。通过自动图像分析，作者在肿瘤和肿瘤周围组织中观察到了不同程度的CD38+CD19+B细胞浸润（图2B）。与scRNA-seq分析一致，作者发现肿瘤中CD38+CD19+B细胞的丰度明显高于肿瘤周围组织（图2C）。此外，CD38+CD19+B细胞数量的增加可能与肿瘤体积增大、淋巴结转移、CA19-9水平升高以及存在血管侵犯有关（图2D）。接下来，作者对PDAC患者的新鲜肿瘤、瘤周组织和外周血进行了流式细胞术检测（图2E），结果证实CD19+CD38+B细胞主要存在于肿瘤中，而不是瘤周组织和外周血中（图2F）。总之，CD38+CD19+B细胞在肿瘤中的丰度明显高于肿瘤周围组织，且与晚期患者特征相关。这些发现进一步提示了CD38+CD19+B细胞作为PDAC诊断和治疗靶点的潜力。

CD38+CD19+B细胞的存在可预测PDAC患者的不良预后

在发现CD38+CD19+B细胞浸润与肿瘤进展之间存在正相关之后，作者利用探索性队列（FUSCC）来探讨这一细胞亚群是否能预测患者的预后，以及外部队列（TCGA）来验证CD38+CD19+B细胞在PDAC中的预后价值。在这两个队列中，总B细胞与PDAC患者的总生存期（OS）无关（图3A和B），这表明PDAC中B细胞具有高度异质性。在两个队列中，肿瘤浸润CD38+CD19+B细胞丰度较高的患者OS明显较短（图3C和D）。此外，在排除年龄、性别、血管侵犯、神经侵犯、肿瘤大小和淋巴结状态等混杂变量后，Cox回归多变量分析显示，CD38+CD19+B细胞浸润是PDAC的一个独立预后因素（图3E）。综上所述，这些研究结果表明，CD38+CD19+B细胞浸润可独立预测PDAC的不良预后。

CD38+CD19+B细胞与PDAC的免疫抑制有关

为了进一步阐明CD38+CD19+B细胞在TME中的潜在机制和功能意义，作者利用TCGA的转录组数据探讨了CD38+B细胞与其他功能性免疫细胞之间的相关性。通过相关性分析，作者观察到CD38+B细胞的丰度与幼稚B细胞、记忆B细胞、记忆激活的CD4+T细胞、调节性T细胞（Tregs）和滤泡辅助性T细胞的丰度呈正相关，表明这些细胞类型之间存在潜在的相互作用或功能关系。相反，它与记忆静止的CD4+T细胞、激活的NK细胞、单核细胞、2型巨噬细胞和激活的肥大细胞的丰度呈负相关（图4A）。重要的是，作者观察到在CD38+B细胞水平较高的PDAC样本中，活化的NK细胞丰度下降，Treg丰度上升（图4B和C），这表明它们具有潜在的免疫抑制表型。

作者的分析表明，瘤内高水平的CD38+CD19+B细胞与Tregs（Foxp3+CD4+T细胞）的增加和活化NK细胞的减少有关（图4D-G）。总之，作者的研究结果表明，CD38+CD19+B细胞富集的TME代表了一种免疫抑制表型，其特点是NK细胞活性降低，Tregs增加，从而提供了潜在的治疗方案。

CD38+CD19+B细胞在PDAC中的免疫调节特征

接下来，作者使用scRNA-seq分析、组织图谱分析和体外实验来探索CD38+CD19+B细胞的免疫特征（图5A）。作者首先评估了与B细胞发育和分化相关的经典标志物。在两个队列中，CD38+B细胞都表现出特定标记物的富集，包括MME，CD10、IL-10、EBI3，IL-27B或IL-35B、TGFB1、GZMB、CD5和CD21（图5B）。然而，CD38+细胞与CD38-细胞之间的CD138和IgM表达量并无明显差异（图5C）。此外，PDAC中CD38+CD19+B细胞表达较高水平的IL-10、IL-35、TGF-β、GZMB、TIM-1、CD5和CD21（图5D）。总之，这些数据揭示了在PDAC中具有调控特征的过渡性B细胞亚群（图5E）。

考虑到CD38+CD19+B细胞的存在与NK细胞细胞毒性之间的负相关，作者接着进行了共培养实验，以验证CD38+CD19+B细胞在免疫微环境中的抑制功能。简而言之，从外周血中分拣出CD38+CD19+B细胞和CD38-CD19+B细胞，然后与NK细胞进行共培养（直接或间接）（图5F）。作者发现与CD38-CD19+B细胞相比，在培养系统中加入CD38+CD19+B细胞会导致直接和间接共培养系统中GZMB、IFN-γ和CD107a的表达减少（图5G）。然后，作者评估了共培养系统上清液中经典的Breg衍生细胞因子，观察到与CD38-CD19+B细胞亚组相比，CD38+CD19+B细胞亚组的IL-10水平显著增加，而IL-35、TGF-β和GZMB变化不大（图5H）。用IL-10阻断抗体预处理CD38+CD19+B细胞可减轻它们对NK细胞细胞毒性的抑制作用（图5I）。总之，CD38+CD19+B细胞表现出Breg样特征，有可能损害NK细胞的效应功能，从而造成PDAC的免疫抑制微环境。

调控CD38+CD19+B细胞富集的微环境可对PDAC的免疫抑制进行重编程

有了这些有力的证据，作者接下来探讨调控PDAC中的CD38+CD19+B细胞是否能重塑体内免疫抑制的TME。作者利用NK细胞耗竭来评估CD38+CD19+B细胞对肿瘤生长的影响是否基于NK细胞，并通过流式细胞术分析证实了耗竭的成功（图6A）。分析发现与CD38-CD19+B细胞相比，CD38+CD19+B细胞的采纳转移能显著促进KPC肿瘤的生长（图6B-D），而对小鼠体重没有明显影响（图6E）。此外，NK细胞耗竭抑制了CD38+/CD38-CD19+B细胞收养转移的肿瘤抑制表型（图6B-D）。与人体内观察到的结果一致，与CD38-CD19+B细胞相比，CD38+CD19+B细胞的采纳转移显著降低了细胞毒性NK细胞的比例，并增加了肿瘤中Treg细胞的浸润（图6F和G）。免疫荧光分析也验证了这些发现（图6H和I）。这些发现共同表明，B细胞亚群表现出功能异质性，与CD38-CD19+B细胞相比，CD38+CD19+B细胞可能具有免疫抑制特性。

抑制CD38可减少PDAC生长并使体内TME敏感化

接下来，作者进行了体内实验来探索PDAC的治疗策略。在使用CD38抑制剂或药物治疗后，每三天测量一次肿瘤大小，以监测肿瘤生长情况。如图所示，在IgG对照抗体治疗组中，使用CD38抑制剂可明显抑制肿瘤生长并减轻肿瘤重量，而NK细胞耗竭可挽救这种疗效（图7B-D）。CD38抑制剂治疗后小鼠体重无明显变化，表明小鼠耐受性良好（图7E）。此外，体外实验也没有观察到CD38抑制剂对KPC细胞增殖的明显影响（图7F），这表明体内观察到的肿瘤生长变化可能是TME的作用，而不是直接抑制肿瘤细胞增殖。此外，体外实验表明，CD38抑制剂不会影响NK细胞中GZMB和IFN-y的表达（图7G），这表明CD38抑制剂可能不会直接影响NK细胞的细胞毒性。为了进一步评估CD38抑制剂对肿瘤微环境的影响，作者应用流式细胞术观察到，CD38抑制剂能显著增加肿瘤组织中NK细胞的比例并减少Treg细胞的浸润（图7H和I）。免疫荧光检测也验证了这一发现，即在使用CD38抑制剂治疗的肿瘤中，Treg细胞数量较少，而细胞毒性NK细胞数量较多（图7J和K）。

研究总结：

在本研究中，作者分析了从PDAC患者身上获得的肿瘤样本，并进行了体内和体外实验，以探索所鉴定的B细胞亚群的功能和机制。本研究表明，PDAC中的CD38+CD19+B细胞与预后不良有关，可能是一个独立的预后因素，它们表现出调节性B细胞的特征，并有助于TME中的免疫抑制。深入研究该亚群在高度免疫抑制的胰腺免疫微环境中的作用，同时制定有针对性的合理治疗策略，将提高PDAC免疫疗法的疗效。