10X单细胞、空间、WES测序分析揭示肿瘤微环境进化区域异质性
作者，Evil Genius
科研和临床其实有很多共同的地方，大家都知道多组学是方向，目前单细胞转录组、ATAC、VDJ、空间转录组、空转VDJ、宏基因组、外显子等几个方向的联系越来越密切，其中单细胞通常在表征肿瘤微环境中有优势，空转在识别空转区域和免疫浸润方面有长处，外显子在确定不同肿瘤区域异质性的突变信息在其准确性，其中还有空间微生物的信息也在多组学之中，这张网越来越大，其实大家看文章多了会发现，其实是在往临床运用方面发展，其中空间和WES是最有价值的。
最近很多人问我失业了该怎么办，问我是怎么度过去年年初失业的时光的，其实大家不要太焦虑，我被开除的时候感觉情况真的是万念俱灰，甚至一度连做人的尊严都丢的无影无踪，不过经历过了才发现，其实无论无论发生什么，首先自己不能看低自己，该做什么做什么，感觉迷茫就迷茫一会儿，千万不要看低自己，不要为了一些虚无缥缈的东西放弃自尊，也千万不要随便找一份工作就去做，而是沿着自己的路往前走。
我们今天来分享一篇文献，Molecular cartography uncovers evolutionary and microenvironmental dynamics in sporadic colorectal tumors，2023年12月发表于Cell，值得大家看一看。
结直肠癌从癌前进展到腺癌的过程中表现出动态的细胞和遗传异质性。文章对31例人类结直肠标本的空间多组学数据进行分析，实现了肿瘤进化的系统区域定位，揭示了个体化的进展轨迹以及伴随的微环境和克隆变化。
INTRODUCTION，我们来总结一下
结直肠癌(CRC)进展的遗传模型定义了驱动人类结肠上皮发育不良和恶性肿瘤的突变事件的累积序列。这种传统的腺瘤-癌轨迹涉及驱动基因APC、KRAS和TP53的改变，导致染色体不稳定(CIN)。另外，来自所谓的serrated pathway的sporadic CRC的一个subset更可能是BRAF驱动的微卫星不稳定(MSI-H)，主要是由于MLH1的双等位基因高甲基化，导致高突变。几十年来的研究已经产生了更多的CRC亚型，阐明了侵袭和转移的替代途径，以及恶性病变前的特征及其临床预后。最近，单细胞和空间分子分析的出现以高分辨率揭示了不同程度的肿瘤内异质性，这表明先前提出的沿常规或锯齿状途径的线性肿瘤进展不能完全解释全球癌症相关死亡的第二大原因的进化动力学。此外，来自空间分辨分析的分层分子信息可用于建立与基因和蛋白质表达或细胞“状态”相关的模型，以跨肿瘤区域的克隆身份。以这种方式对肿瘤系统地理学进行探索，可以在考虑区域异质性的同时，对进化关系进行更深入的分析。
除此之外，可能是恶性细胞自身遗传进化的基础，肿瘤上皮和浸润性免疫细胞之间的相互作用引入了额外的复杂性，这种相互作用提供了免疫原性选择压力，深刻影响肿瘤的进化和预后。事实上，与传统的病理分期相比，实体肿瘤免疫区域的特征已被证明是更好的预测患者预后的指标，肿瘤免疫表型是预测几种癌症对免疫检查点阻断(ICB)反应的有价值的指标。此外，从起始到恶性的不同途径混淆了这些肿瘤的特征，因为锯齿状病变和MSI-H CRC平均比常规腺瘤和微卫星稳定型(MSS)肿瘤更具有免疫原性。重要的是，一些类型的晚期实体瘤已被证明通过癌细胞固有的机制和观察到的微环境表现出免疫排斥或逃避，这缩短了患者的总体生存期并赋予了ICB耐药性。在结直肠癌中，观察到的细胞毒性免疫抑制在晚期癌中随着干细胞特征的增加而增加，这引发了关于免疫排斥及其与肿瘤进展的潜在联系的关键问题。
为了绘制结直肠肿瘤细胞及其微环境的共同进化图谱，利用空间多组学构建了结直肠癌从癌前病变到腺癌进展的系统区域图谱，该图谱有助于构建人类肿瘤图谱网络(HTAN)。分析从一组异质性散发性结直肠肿瘤中生成了一个空间分辨率高的数据集，其中不同的肿瘤区域代表了癌症进化的snapshots。多区域突变谱、非靶向空间转录组学(ST)和多重蛋白质成像在维持组织背景的同时，提供了分层分子信息的高维配对测量。
结合空间数据和单细胞RNA测序(scRNA-seq)来列举一致的细胞状态，分析将肿瘤程序和微环境特征投射到progression pseudotime(PPT)上，该时间源自肿瘤队列中的区域拷贝数变异(cnv)和体细胞突变谱。这些努力发现了在染色体不稳定(CIN+)和超突变(HM) CRC的进展过程中明显改变的多种途径，包括MSS CIN+ CRC向免疫排斥的过渡。
研究成果
空间图谱查询散发性结直肠肿瘤的分子异质性
- 样本类型：选择31个具有代表肿瘤进展阶段过渡的区域形态学的人类结肠标本(同时具有癌前、恶性和侵袭性区域的样本),其中MSS (n = 12) and MSI-H (n = 10) as well as pre-cancerous tumor subtypes (n = 8; 4 SSL/HP and 4 TA/TVA). 还有a normal colon sample。
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技术：单细胞、空间、WES（FFPE样本）
这一部分主要是表征，查看不同部位的突变信息以及表达信息。
空间CNV图谱与克隆进化
引起MSS CRC的传统腺瘤-癌序列的一个标志是CIN，它导致体细胞gain、loss和可遗传给细胞后代的大片段DNA重排。因此，如果在空间上测量，CNVs的累积增加可用于在肿瘤区域之间排序肿瘤进展事件。
- 推断CNV，包括ST，scRNA-seq, WES, and WGS。
ST和SC数据推断的CNV的结果进行聚类分析。并且分析转录组数据（SC和ST）、基因组数据（WGS、WES）的CNV事件的相关性。综上所述，这些数据表明，CIN在癌症发展过程中的发病时间比之前假设的要晚，并且MSS肿瘤比MSI-H肿瘤更有可能成为CIN+。然而，确实观察到一些MSI-H肿瘤获得CIN。事实上，该图谱中有三个MSI-H肿瘤的区域被分类为CIN+。这些例外情况类似于HM TA/TVA/MSS肿瘤，表明在某些情况下会出现CIN的替代途径。
多区域体细胞突变谱提供了系统区域拓扑结构
外显子数据的体细胞突变肿瘤进化，作者使用全外显子测序（LCM-WES）进行体细胞突变谱分析。22例患者的LCM-WES结果在多个ROI中表现出可观察到的系统演化。ROI之间的遗传改变可以重建肿瘤区域之间的进化关系。
当利用系统发育结构对图谱中的癌症进行分类时，作者观察到22例肿瘤中有8例表现出线性进化，其特征是公共突变多和区域异质性低。剩下的14例肿瘤中，作者将6例归类为中性，8例归类为分支，其特征是公共突变少和区域异质性高。在CIN+肿瘤中仅有2例的演变被归类为线性.
作者建立了PPT排序，并计算了肿瘤区域的CIN指数(量化CIN和高突变的比较程度)，定义为LCM ROI和CNV克隆的组合。PPT排序沿着从正常粘膜和癌前腺瘤到浸润性腺癌进展的全局指标进行图谱级整合和空间信息建模。CIN指数结合了每个区域的CNV和突变信息，优先考虑动态范围较大的信息进行PPT排序。该指数自然地将晚期肿瘤区(PPT > 0.4)的CIN+(阳性指数)和HM(阴性指数)肿瘤划分为两个不同的轨迹。在CIN+和HM PPT上检查单个肿瘤的区域，发现了空间异质性的实例，分别描述了从MSI-H到CIN+和MSS到HM的交叉过渡。重要的是，在CIN指数高的肿瘤区域，TP53突变比APC突变更丰富，证实了CIN在CRC发展的后期出现.
Cell-state deconvolution reveals pseudotemporal tissue dynamics
利用NMF的方法解析细胞分类状态，并通过解卷积计算细胞状态在每个空间转录像素中的贡献。同时，使用细胞-细胞相互作用群体重建算法，将组织划分为不同细胞状态组成的区域。研究还观察到不同肿瘤类型和进展阶段的细胞状态动态变化，以及免疫细胞在环境中的分布。通过建立广义加性模型，研究揭示了细胞状态在结直肠癌演化过程中的重要作用。具体而言，研究发现在癌前病变转变为CIN+和HM的过程中，正常细胞被癌特异性上皮状态细胞所取代。CIN+结直肠癌表现出一种排斥或逃避免疫系统的上皮内固有程序，导致CD8+淋巴细胞和其他免疫作用减少。而在HM肿瘤中，浸润的免疫细胞群体则有所增加。这表明在CIN+结直肠癌中存在一种上皮内固有程序，用于排斥或逃避细胞毒性宿主免疫系统。
Gene expression features of CIN+ CRCs predict immune exclusion
研究人员对CIN+肿瘤进展与免疫排斥关系进行深入探索。他们发现了与免疫排斥相关的基因，包括DDR1, TGFBI和PAK4，并确定了一个与细胞外基质（ECM）信号转导和结构相关的功能模块。这些基因在CIN+晚期呈显著上调。此外，研究发现DPEP1基因在肿瘤进展过程中表达显著增加，可能参与免疫排斥。因此，由DDR1, TGFBI，PAK4和DPEP1四个基因组成的免疫排斥（IEX）标志物，成为CIN+结直肠癌免疫治疗的潜在靶点，成为预测肿瘤免疫排斥的生物标志物。研究人员通过免疫组化数据验证了免疫排斥的存在，还观察到富含胶原的基质可以隔离免疫浸润物。进一步的研究结果显示具有高IEX分数（IEX+）的肿瘤区域中CD8+ T细胞浸润较少，而具有低IEX分数（IEX-）的区域则有大量CD8+ T细胞存在。
IEX trends with tumor progression and predicts poor patient outcomes
通过对大型scRNA-seq样本进行分析，发现IEX+的结直肠癌中T细胞表现出静止和耗竭状态的基因特征和代谢途径变化。这些结果揭示了肿瘤细胞与其微环境的共同演化，在CIN+肿瘤中导致免疫抑制。研究还发现IEX评分较低的HM肿瘤中存在其他与免疫耐受微环境相关的细胞状态。癌相关成纤维细胞和髓系细胞可以促进免疫抑制的微环境，而一些其他类型的成纤维细胞则具有对抗免疫抑制效应。这说明在CIN+结直肠癌中，肿瘤细胞与微环境共同演化，导致CD8+ T细胞在肿瘤微环境中被排斥和抑制。而在HM结直肠癌中，存在其他的免疫耐受路径。对人类肿瘤标本的分析表明，IEX主要由肿瘤细胞表达，通过其评分可以预测肿瘤中CD8+ T细胞的浸润程度和激活状态。IEX在肿瘤进展过程中与免疫排斥的程度相关，IEX高表达与肿瘤的进展和患者不良预后相关。蛋白质表达数据也证实了IEX作为预后指标的价值。最后，通过改变肿瘤中IEX蛋白质DDR1的表达，研究人员验证了IEX在抑制肿瘤进展中的作用。
了解研究意义的同时看一下分析方法
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