RNA-Pull down实验详细操作方法

RNA-Pull down实验详细操作方法步骤：

一、细胞收集(对于单层细胞或贴壁细胞)

1.准备细胞5E7细胞。

2.用10 mL冰冷的PBS洗涤培养瓶或平板上的细胞两次。

3.加入10 mL冰冷的PBS。从每个培养瓶或平板上刮下细胞，然后转移到离心管。

4.通过在4°C下以1500 rpm离心5 min来收集细胞，并丢弃上清液。细胞沉淀-80℃保存。

二、细胞裂解

1.解冻细胞颗粒。

2.通过在4°C下以2000 g离心3 min将细胞制成颗粒。

3.去除残留的PBS。

4.称量每个颗粒。

5.制备完全裂解缓冲液。每个100 mg细胞颗粒添加5 µL 200X蛋白酶抑制剂和5 µL RNase抑制剂到1.0 mL裂解缓冲液中。搅拌均匀。

6.将每100 mg细胞沉淀重新悬浮在1.0 mL完全裂解缓冲液中，超声裂解。

7.4℃12000 g离心10 min，取上清到新的1.5 ml EP中，并在-80°C下保存，或继续进行免疫沉淀。

三、生物素标记目标RNA

表1：基本反应组分和反应量

需要的孵育时间从 37°C 下 30 分钟（针对结构不太复杂的 RNA）到 4 到 16°C 下孵育过夜（针对序列较长或结构较为复杂的 RNA）不等。

四、预洗涤链霉亲和素磁珠（可选）

1.通过轻轻的翻转，重新悬浮在原小瓶中的珠子。

2.取出需要的量，转移到无核酸酶的管中。

3.将管子放置在磁性支架上，去上清收集磁珠。

4.用2倍体积的0.1 M氢氧化钠，50 mM氯化钠（无核酸酶）洗珠子两次。

5.用100 mM氯化钠清洗珠子一次。

6.继续平衡磁珠以进行RNA捕获。

五、标记的RNA与链霉亲和素磁珠的结合

注：每20-50µL磁珠使用25-100pmol的RNA范围。下面的说明使用了50pmol的RNA到50µL的珠子。

1.将50µL的链霉亲和素磁珠加入到一个1.5 mL的微离心管中。

2.将管子放入一个磁性支架中，收集在管子侧面的珠子。取出并丢弃上清液。

3.用等体积的20mM Tris（pH 7.5）洗涤。通过移液或涡旋重新悬浮珠子。

4.重复步骤2和步骤3。

5.将管子放入一个磁性支架中，收集在管子侧面的珠子。取出并丢弃上清液。

6.加入等体积的1X RNA捕获缓冲液。通过移液或涡旋重新悬浮珠子。

7.在珠子中加入50pmol的标记RNA。通过移液轻轻混合。

8.在室温下旋转孵育15-30分钟。

六、RNA结合蛋白与RNA的结合

1.将管子放入一个磁性支架中，以收集紧贴在管子侧面的珠子。取出并丢弃上清液。

2.用等体积的20mM Tris（pH 7.5）洗涤。通过移液或涡旋重新悬浮珠子。

3.重复步骤1和步骤2。

4.将管子放入一个磁性支架中，以收集紧贴在管子侧面的珠子。取出并丢弃上清液。

5.将10X蛋白质-rna结合缓冲液稀释至1X（即每个反应用10µL制成90µL的超纯水。

6.在珠子中加入100µL的1X蛋白-rna结合缓冲液，混合均匀。

7.准备一个rna-蛋白质结合反应的主混合物（表2）。

表2.RNA-蛋白结合反应的主混合物的反应成分。

8.将管子放入一个磁性支架中，收集在管子侧面的珠子。取出并丢弃上清液。

9. 在与rna结合的珠子中加入100µL的Master Mix。通过移液或温和的旋转来混合。

10.在4°C下搅拌或旋转孵育30-60分钟。

七、 RNA结合蛋白复合物的洗涤和洗脱

1.将管子放入一个磁性支架中，收集在管子侧面的珠子。将上清液转移到试管中以供以后分析。

2.用等体积的1X洗涤缓冲液（100 µL）洗涤。

3.重复步骤1和步骤2两次。如果需要的话，保存洗涤上清液以供分析。

4.将管子放入一个磁性支架中，收集在管子侧面的珠子。将上清液转移到试管中以供以后分析。

5.在珠子中加入50 µL的洗脱缓冲液，通过涡旋搅拌均匀。在37°C下搅拌孵育15-30 min。

6.将管子放入一个磁性支架中，收集在管子侧面的珠子。

7.取出上清液，进行下游分析。

8.如果下游检测是Western blot，将样品缓冲液减少到1X。

9.在95-100°C下加热5-10 min。电泳样品加到凝胶上或存储在-20°C，直到使用。

八、Western blot

1.配胶。

2.上样，跑电泳，恒压100 min

3.转膜，湿转250 mA恒流转1-2 h。

4.封闭，将PVDF膜放入5%的脱脂牛奶中，封闭1 h。

5.孵育一抗（PBS稀释），4℃孵育过夜。

6.TBST洗膜3次，每次5 min。

7.孵育二抗（TBST稀释），室温孵育1 h。

8.TBST洗膜3次，每次5 min。

9.按1：1的比例将ECL发光液均匀滴到膜上

10.曝光，显影，定影。

九、蛋白银染

1.固定：电泳结束后，取凝胶放入约100 ml固定液中，在摇床上室温摇动20 min，摇动速度为60-70 rpm。固定40min以上甚至过夜可以进一步降低背景。

2.30%乙醇洗涤：弃固定液，加入100 ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10 min，摇动速度为60-70 rpm。

3.水洗涤：弃30%乙醇，加入200 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10 min，摇动速度为60-70 rpm。如果本步骤用水洗涤更长时间，对降低染色的背景略有帮助。

4.增敏：弃水，加入100 ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2 min，摇动速度为60-70 rpm。

5.水洗涤(共2次)：弃原有溶液，加入200 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1 min，摇动速度为60-70 rpm。弃水，再加入200 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1 min，摇动速度为60-70 rpm。

6.银染：弃水，加入100 ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10 min，摇动速度为60-70 rpm。

7.水洗涤：弃原有溶液，加入100 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5 min，摇动速度为60-70 rpm。注意：水洗涤的时间不能超过1.5 min。

8.显色：弃水，加入100 ml银染显色液，在摇床上室温摇动3-10 min，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70 rpm。

9.终止：弃银染显色液，加入100 ml银染终止液(1X)，在摇床上室温摇动10 min，摇动速度为60-70 rpm。

10.水洗涤：弃银染终止液，加入100 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动2-5 min，摇动速度为60-70 rpm。

11.保存：可在Milli-Q级纯水或双蒸水中保存。或采用适当的方式制备成干胶。

十、实验结果

10.1 WB预实验验证抗体质量（WB项目-质控1）

例如：

结果说明：抗体质量正常，可以进行WB正式实验。

10.2 银染结果（MS项目-质控2）

例如：

结果说明：银染结果显示目的探针组有差异蛋白拉出，可进行后续的质谱分析。

10.3 质谱结果

例如：

结果说明：详细质谱结果见附件。

10.4 RPd-WB结果

例如：

结果说明：通过RPd-WB验证目的RNA和候选蛋白互作。

本次实验的目的是使用RNA-Pull down-MS或者RNA-Pull down-WB的方法，通过体外转录法标记生物素RNA探针，在目的细胞中通过目的探针把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化并对结合在复合物上的蛋白进行MS或WB分析，寻找目的RNA的靶标蛋白，或在不同遗传背景或处理条件下的互作变化。

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参考文献：

LINC00941 promotes pancreatic cancer malignancy by interacting with ANXA2 and suppressing NEDD4L-mediated degradation of ANXA2.” Cell death & disease 2022.