CoIP实验流程方法及质控

本次实验的目的是使用CoIP-MS或者CoIP-WB的方法，通过在目的细胞中运用针对目标蛋白的抗体把相应的蛋白-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化并对结合在复合物上的蛋白进行MS或WB分析寻找目标蛋白相互作用的蛋白，或在不同遗传背景或处理条件下的互作变化。

CoIP实验方法步骤详解：

一、细胞的收集及裂解

1.收集2E7个细胞样品，加入PBS洗涤细胞，离心后弃上清收集细胞沉淀。

2.准备500 μl 预冷的 Cell Lysis Buffer,分别加入5 μl Protease Inhibitor、5 μl PMSF，混匀后加进细胞沉淀中吹打均匀，冰上孵育 30 min，期间涡旋混匀几次。

3.4℃,12000 rpm 离心10 min，取上清，进行蛋白浓度测定及后续实验。

二、免疫复合物的制备

1.在离心管中，将每个样品的细胞裂解液与 2-10 μg 免疫沉淀抗体结合。每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为 500-1000 μg，由 Pierce BCA Protein Assay蛋白浓度检测试剂盒测定。

2.用免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液将抗体/裂解液稀释至 500 μL。

3.在室温下孵育 1-2 h，或 4℃过夜，以形成免疫复合物。

三、免疫沉淀

1.将 25 µL (0.25 mg) 的 Pierce 蛋白 A/G 的磁珠加入1.5 mL 离心管中。

2.向磁珠中加入 175 µL 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液，轻微涡旋混匀。

3.将离心管放入磁力架中收集磁珠到离心管的一边。去除上清。

4.向离心管中加入 1 mL 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液。颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1 min。用磁力架收集磁珠。去除上清。

5.将抗原样品/抗体混合物加入盛有磁珠的离心管中，保持混匀室温下孵育1 h。

6.用磁力架收集磁珠，除去未结合的样品，保存以备分析。

7.向离心管中加入500 µL 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液，轻柔混匀。收集磁珠，弃上清。再重复洗两次。

8.向管中加入 500 µL 超纯水，轻柔混匀。用磁力架收集磁珠，弃上清。

9.低 pH 洗脱：向离心管中加入 100 µL 洗脱液。保持混匀在室温下孵育离心管 10 min。 通过磁力分离磁珠，保留含有目的抗原的上清。每 100 µL 洗出液中加入 10 µL 中和液来中和低 pH。 备选洗脱方法：向离心管中加入 100 µL 1X电泳上样缓冲液，将样品置于加热器中， 96- 100℃加热 10 min。通过磁力架分离磁珠，保留含有目的抗原的上清。

四、Western检测目的蛋白

1.配胶。

2.上样，跑电泳，恒压100 min。

3.转膜，湿转250 mA恒流转1-2 h。

4.封闭，将PVDF膜放入5%的脱脂牛奶中，封闭1 h。

5.孵育一抗（PBS稀释），4℃孵育过夜。

6.TBST洗膜3次，每次5 min。

7.孵育二抗（TBST稀释），室温孵育1 h。

8.TBST洗膜3次，每次5 min。

9.按1：1的比例将ECL发光液均匀滴到膜上

10.曝光，显影，定影。

五、银染

1.固定：电泳结束后，取凝胶放入约100 ml 固定液中，在摇床上室温摇动20 min，摇动速度为60-70 rpm。固定40 min以上甚至过夜可以进一步降低背景。

2.30%乙醇洗涤：弃固定液，加入100 ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10 min，摇动速度为60-70 rpm。

3.水洗涤：弃30%乙醇，加入200 ml Milli-Q级纯水或双蒸水, 在摇床上室温摇动10 min，摇动速度为60-70rpm。如果本步骤用水洗涤更长时间，对降低染色的背景略有帮助。

4.增敏：弃水，加入100 ml 银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2 min，摇动速度为60-70 rpm。

5.水洗涤(共2次)：弃原有溶液，加入200 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1 min，摇动速度为60-70 rpm。弃水，再加入200 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1 min，摇动速度为60-70 rpm。

6.银染：弃水，加入100 ml 银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10 min，摇动速度为60-70 rpm。

7.水洗涤：弃原有溶液，加入100 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5 min，摇动速度为60-70 rpm。注意：水洗涤的时间不能超过1.5 min。

8.显色：弃水，加入100 ml银染显色液，在摇床上室温摇动3-10 min，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70 rpm。

9.终止：弃银染显色液，加入100 ml 银染终止液(1X)，在摇床上室温摇动10 min，摇动速度为60-70 rpm。

10水洗涤：弃银染终止液，加入100 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动2-5 min，摇动速度为60-70 rpm。

11.保存：可在Milli-Q级纯水或双蒸水中保存。或采用适当的方式制备成干胶。

六、Western检测结果

1.WB验证抗体质量（质控1）

例如：

结果说明：WB检测目的样本中有目的蛋白的信号，说明抗体有效以及蛋白没有发生降解。

2.IP产物WB检测（质控2）

例如：

结果说明：KIF2C抗体能把自身蛋白特异性富集下来（质控），以及能特异性结合TBC1D7（WB验证候选互作蛋白）；同时反向验证TBC1D7抗体能把自身蛋白特异性富集下来（质控），以及能特异性结合KIF2C（WB验证候选互作蛋白）。

七、质谱结果

1.银染结果（质控3）

例如：

结果说明：银染结果显示有差异条带，可进行后续MS分析。