核酸抽提对基因测序的重要性，核酸抽提原理，方法的选择，以及前处理

核酸抽提是基因测序流程中至关重要的步骤。高质量的核酸样本是确保测序准确性和可靠性的基础。以下是核酸抽提对基因测序的重要性：

（看的人多了我就能喝杯咖啡了  微信公众号同名）

纯度和完整性：核酸纯度直接影响测序结果的质量。杂质如蛋白质、盐和有机物会干扰测序反应，导致数据不准确。核酸的完整性对于长读长测序尤其重要，断裂的DNA会影响序列的连续性。

测序效率：高效的核酸提取方法能够最大限度地回收样本中的核酸，提高测序通量。自动化提取方法（如磁珠法）能够节省时间和人力，适合大规模测序项目。

下游应用的兼容性：提取方法需与下游测序技术兼容。不同测序平台（如Illumina、PacBio、Oxford Nanopore）对核酸样本的要求不同。例如，PacBio和Oxford Nanopore需要高分子量DNA，而Illumina则对DNA长度要求较低，但需要高纯度。

具体例子

Illumina测序：要求DNA样本纯度高、片段均一。使用膜过滤柱法或磁分离法提取的DNA通常能满足这些要求。

PacBio测序：需要高分子量DNA，磁珠法提取的DNA由于较少机械剪切，适合该平台。Oxford Nanopore测序：需要长片段、高质量DNA，磁分离法和柱式法均可使用，但需注意操作中减少DNA断裂。

实际应用

肿瘤基因组测序：要求高质量的DNA，以便准确检测突变和结构变异。

宏基因组测序：需要从复杂环境样本中提取DNA，磁珠法由于高通量和自动化特性广泛应用。

核酸抽提包括两个主要步骤：裂解和纯化。

裂解步骤目的：释放样品中的核酸。

常用试剂：去污剂（如SDS、Tween 20）和盐（如Tris、EDTA）。作用：去污剂变性蛋白质，破坏膜结构；盐提供适宜的环境并保护核酸。

纯化步骤：目的：分离核酸和其他杂质。

方法：醇沉淀：使用醇沉淀核酸，分离盐。

 介质纯化：利用固相介质选择性吸附核酸。

快速提取：不进行纯化，适用于紧急情况。

主要方法

01酚氯仿法

苯酚和氯仿均为有机溶剂，其萃取核酸原理是苯酚与氯仿对于与核酸结合的蛋白质有极强的变性作用，但对核酸本身没有影响。经离心后，形成上层水相下层酚/氯仿相，变性后的蛋白质溶于酚/氯仿相或者在两相交界处形成凝胶层，而核酸易溶于水而不溶于有机溶剂从而留在水相；同时，氯仿可以有助于有机相与水相的分离和去除溶于水的部分酚。最后，再将核酸通过乙醇沉淀即可达到提取的目的。

此法的缺点是：蛋白质难以彻底去除；操作难度大且费时；使用危险化学品；热裂解法

02 热裂解法

样本中加入促细胞裂解的化学物质（SDS、Tween 20等），可加入蛋白酶K消化一段时间，也可不加，95℃以上加热10分钟左右；高速离心，上清中的DNA即可用于PCR扩增。该方法操作简便，成本低，一般仅用于血清或体液中病原体核酸的提取。

此方法在临床应用广泛，但缺点是：核酸纯度低，产量低；提取出的核酸除了PCR外不能直接用于其它分子生物学操作。我们常用的 细菌PCR检测就是用的这个原理，主要步骤就是金属浴

03膜过滤柱法

此种方法是利用核酸表面会覆盖一层由水分子构成的薄膜，在高盐环境下，这层亲水膜会遭到破坏从而核酸可被吸附在离心柱上，而其他杂质如蛋白质、代谢产物等则会被离心沉淀与核酸分离。最后通过洗脱，将核酸从吸附膜上脱离，即可得到纯化后的核酸。这也是试剂盒提取中广泛使用的方法。

但即便如此，该方法仍存在缺点：高度依赖吸附膜的结合能力；洗脱不完全导致核酸流失；无法大量提取核酸，较难实现自动化。

例子：天根的柱式试剂盒（如EasyPure DNA Kit），用过的大伙肯定都明白

04磁珠分离法

携带正电荷的磁珠易于吸附负电荷的核酸，主要用于从人血清或血浆样品中提取DNA 和RNA（例如从血液样本中检测HIV 或HBV 病毒基因组的样品制备）。一般而言，将样品与结合缓冲液和磁珠混合，核酸与磁珠结合后，经过数次洗涤与磁场捕获，洗脱下来的核酸即可通过PCR或其它特定方法来检测特定的DNA或RNA。磁分离法也是广泛应用于诊断行业，且能实现高通量、自动化的核酸提取方法。

例子：凯杰的QIAamp DNA Mini Kit和自动化平台QIAcube，天根的磁珠法试剂盒（如MagPure DNA Kit）。还有硕世的等等

大家用的自动化抽提仪通常都是用的磁珠法

不同样本的前处理方法也不同：

1.器官，组织，阳性菌  建议使用前进行研磨

2.其它的偷个懒，直接把说明书搬过来了

创作不易，麻烦大家点赞关注！！！！

您的关注是我不断前进的动力！！！