https://www.nature.com/articles/s41467-022-33982-7#Sec2

一、研究背景

1. 子宫内膜癌的分类和流行病学

（1）子宫内膜癌（Endometrial Cancer, EC）主要分为以下两种类型：
①子宫内膜样腺癌（Endometrioid Endometrial Cancer, EEC）：这是最常见的类型，通常与雌激素依赖性有关，预后相对较好。
②浆液性子宫内膜癌（Serous Endometrial Cancer, SEC）：这是另一种重要的类型，通常不依赖于雌激素，生物学行为更具侵袭性，预后较差。

  此外，根据发病机制和生物学行为特点将子宫内膜癌分为雌激素依赖型（Ⅰ型）和非雌激素依赖型（Ⅱ型）。雌激素依赖型子宫内膜癌大部分病理类型为子宫内膜样腺癌，少部分为黏液腺癌；非雌激素依赖型子宫内膜癌病理类型包括浆液性癌、透明细胞癌、癌肉瘤等。

（2）流行病学
  近年来，子宫内膜癌发病率呈上升趋势，这可能与人群生活方式的改变以及激素暴露等因素有关，随着社会老龄化和城镇化的加剧，子宫内膜癌已逐渐成为影响女性健康的主要生殖道恶性肿瘤之一。2020年全球癌症统计数据显示，子宫内膜癌新发病例达417,367例，新增死亡病例达97,370例，EEC占所有EC病例的65-85%。因此，对EEC肿瘤发生机制的全面理解将有助于改进该疾病的诊断和治疗。

2. EEC的发病机制和细胞起源

EEC的发病机制：在长期暴露于没有孕激素保护的雌激素下，子宫内膜会出现不受控制的增生，从正常子宫内膜发展到不典型子宫内膜增生（AEH，EEC的癌前阶段），最终发展为EEC。
EEC的细胞起源：以前的研究推测EEC可能起源于子宫内膜的各种细胞谱系，包括上皮细胞和间质干细胞。然而，最近的一项研究报道，鼠子宫内膜中的Axin2阳性上皮干细胞在激活Ctnnb1基因后可以发展为EEC。
科学问题：迄今为止，现有证据不足以明确支持EEC的具体起源。

3. 单细胞测序（scRNA-seq）技术

相比于传统RNA测序（bulk RNA-seq），scRNA-seq可以根据单细胞分辨率下的特征转录组将组织中成千上万的细胞归类为特定的细胞簇。通过分析从正常子宫内膜到子宫内膜样腺癌（EEC）病理进展中的细胞群体演变和转录变化，可以帮助理解EEC的病理进程。

4. 肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）在EEC中的作用

肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）和抑制性免疫微环境促进子宫内膜癌增殖和转移。根据免疫细胞浸润，Li, B. L.等将TME分为C1-C4型，其中C1免疫亚型巨噬细胞和淋巴细胞浸润最少，最高的转移率和最差的总体预后。C2免疫亚型IFN-γ通路活跃，巨噬细胞极化为M1型，较差的生存率。C3免疫亚型为炎症类型，免疫活动最强，巨噬细胞和淋巴细胞浸润最多，显著的Th17特征，具有最高的总体生存率。C4免疫亚型为免疫平衡类型，免疫细胞浸润和平衡的免疫通路激活，预后中等。但从正常子宫内膜到EEC形成过程中TME的全貌仍然不清楚。揭示从正常子宫内膜到EEC过程中TME的特征变化，可以确定TME在EEC肿瘤发生中的功能。

Li, B. L. & Wan, X. P. Prognostic significance of immune landscape in tumour microenvironment of endometrial cancer. J. Cell Mol. Med 24, 7767–7777 (2020). https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jcmm.15408
Subramaniam, K. S. et al. Cancer-associated fibroblasts promote proliferation of endometrial cancer cells. PLoS One 8, e68923 (2013). https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0068923

二、拟解决的科学问题

1. EEC的细胞起源和转录组变化如何影响疾病的发展和进展？
2. EEC是如何从正常内膜经历非典型子宫内膜增生（AEH）向内膜样癌发展演变的？
3. EEC的细胞群体组成和拷贝数变异在病理进程中的动态变化如何影响肿瘤微环境？

三、研究内容

1. 利用单细胞转录组数据，对正常、AEH和EEC子宫内膜组织中的细胞类型进行鉴定和分类。

a. 经过质控，总共有99,215个细胞被收集，每个细胞平均检测到2317个基因。
根据之前报道的细胞标志物，作者识别出六种主要的已知细胞类型：上皮细胞（EPCAM、CDH1）、间质成纤维细胞（DCN、COL6A3）、内皮细胞（PECAM1、PCDH17）、淋巴细胞（CCL5、STK17B）、巨噬细胞（MS4A6A、CD68）和成纤维细胞（ACTA2、RGS5）。此外，作者还发现了一种新的上皮细胞类型，称为“无纤毛上皮细胞”，这种细胞类型在之前的实验中被描述为“无纤毛上皮细胞”（EPCAM + CDHR3-FOXJ1-）。
b. t-SNE降维图展示不同细胞类群
c. 展示了每个定义的细胞类型的表达热图，以反映细胞群体的特异性。

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2. 研究正常、AEH和EEC子宫内膜组织中不同细胞类型的比例和分布情况。

Increased epithelium is the pathological manifestation of endometrial
carcinoma [22.] However, dynamic changes in the proportion of all cell
types from normal endometrium, to AEH, and to EEC have not been
reported.

(1) 单细胞测序数据分析提示：上皮细胞的比例在AEH中增加，并在EEC中进一步扩大。同时，间质成纤维细胞的比例从正常子宫内膜到EEC发生了显著下降。该结论通过组织免疫荧光进行验证。此外，每组细胞类群的特征基因均值与正常组进行Spearman相关性分析，再次说明AEH和EEC的上皮细胞类群与正常组显著不同。

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(2) 拷贝数变异(CNVs)分析提示：AEH和EEC中的上皮细胞的CNVs与正常组相比存在显著增加（5个EEC样本中CNVs的分布与正常组相比，也提示上皮细胞CNVs增加，而组内没有显著差异）。接下来，通过将正常上皮作为对照，分析AEH和EEC样本中上皮细胞的单细胞CNVs，并基于转录组推断大范围的染色体CNVs，发现高CNVs通常发生在染色体1、8或10上（补充图3c）。这与TCGA数据集的结果一致，表明这些可能是导致肿瘤进展的典型CNV亚克隆。

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以上结果提示具有高CNVs的上皮细胞可能子宫内膜癌细胞，然而其具体细胞起源仍不清楚。

3. 明确EEC中上皮样肿瘤细胞的起源

①根据文献，EEC肿瘤细胞来源可能是间充质干细胞或子宫内膜上皮干细胞。
②根据上皮细胞比例增加伴随着间质成纤维细胞比例的减少，提示间质上皮转化（MET）可能是EEC肿瘤细胞的来源

（1）RNA velocity analysis（上皮和间质细胞分别为两个独立的进化轨迹，未见相互转化的轨迹）和MET基因表达分布。此外，根据上皮细胞和间质成纤维细胞的特异性marker分布，未发现MET或MET等转化细胞类型（即两种marker共表达的细胞类群）。提示EEC肿瘤细胞主要起源于子宫内膜上皮细胞。

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(2) 分组（split）t-SNE显示14,28细胞群在AEH和EEC中显著增多，根据marker基因在t-SNE图显示结果发现，14,28细胞群属于unciliated上皮细胞（EPCAM+WFDC2+CDHR3-FOXJ1-）。提示EEC肿瘤细胞可能起源于unciliated上皮细胞。

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(3) 提取unciliated上皮细胞进行subpopulation细分，发现健康组的unciliated上皮细胞主要有 glandular cells (FOXA2, SMAD9) or luminal cells (WNT7A)组成，而EEC的unciliated上皮细胞在不同样本间的异质性较大，其中clusters 14, 15, 26, and 32在EEC中分布较一致，信号通路分析发现 clusters 14 and 15 主要富集TNF and IL-17 信号通路, clusters 26 and 32 主要富集Hippo and Wnt 等与肿瘤发生发展相关的信号通路。进一步使用RNA velocity analysis发现这群肿瘤细胞亚群主要来源于unciliated中的Glandular上皮细胞。通过Findmaker得到这群肿瘤细胞的基因特征，并命名为 LCN2+/SAA1/2+ unciliated epithelial cells。

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(4) 组织免疫荧光验证

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(5) TCGA数据验证

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以上结果说明EEC肿瘤细胞主要起源于子宫内膜unciliated上皮细胞，并特征性高表达 LCN2和SAA1/2，且与EEC预后相关。

4. 探讨肿瘤相关基质成纤维细胞（cancer-associated stromal fibroblasts，CAFs）对EEC发生发展的作用

(1) 提取stromal fibroblast进行subpopulation细分，通过FindeMarkers识别不同亚群的特征性基因，使用常见标志物和KEGG信号通路富集分析对亚群进行标记，并对细胞亚群的百分比进行组间比较，发现BMP + fibroblast (positive
for BMP3, BMP4 and BMP7)在EEC中比例稍微升高， 而WNT subtype, pericyte, and myofibroblast无明显差异，提示stromal fibroblast在健康内膜和EEC发生发展中均具有重要作用？
(2) 提取健康内膜和EEC肿瘤组织中的stromal fibroblast和EEC类器官进行共培养，检测stemness-related genes (ALDH1, AXIN2, CD133, MYC, and SOX9)的RNA水平，结果发现健康内膜或EEC肿瘤组织的stromal fibroblast均可上调EEC类器官细胞的干性指标。说明所有类型的stromal fibroblast在健康内膜和EEC发生发展中同样重要？

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方法学：根据基质细胞更易解离的特性，分离基质细胞和上皮细胞

5. 探讨免疫微环境在EEC中的特征及作用

(1) 提取免疫细胞（提取一开始进行分群的Lymphocyte和Macrophage？）进行亚群细分，通过FindeMarkers识别不同亚群的特征性基因，使用常见标志物CD3D + T cells, CD68 + macrophages, NCAM1 + NK cells, CD1A + dendritic cells, CD79A + B cells, KIT + mast cells, and FCGR3B + neutrophils进行亚群标记，组间比较亚群比例，结果提示T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞在健康内膜、AEH和EEC中的分布没有显著差异。但是，Lymphocyte和Macrophage在总的细胞分布下，其细胞比例在AEH和EEC中较健康内膜是上调的，这里的免疫细胞大类分群，是否应该在所有细胞下进行？

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(2) 对单核巨噬细胞进行分群：传统M1 (positive for IL1A and IL1B) and M2 (positive for CD163 and IL10)不能对Macrophage进行分群。根据其他疾病的单细胞数据研究成果https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286742030341X和https://www.nature.com/articles/s41591-020-0901-9，使用FCN1 + (cluster1), SPP1 + (clusters 0, 3, 4) and cycling (cluster 2, positive for TYMS and MKI67) 对macrophages进行标记，并对相应cluster的marker基因使用KEGG信号通路富集分析，明确该分类的可行性（FCN1+巨噬细胞与细胞因子分泌和细胞炎症反应相关，SPP1+巨噬细胞与淋巴细胞活化有关，cycling巨噬细胞是一群具有增殖活性的巨噬细胞），与文献报道的巨噬细胞亚群功能类似。但这3个巨噬细胞亚群在健康内膜、AEH和EEC病灶之间的分布无显著差异。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610813000330

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(3) 对T细胞进行分群：根据文献将CD8+ T细胞分为naïve（静息状态或未激活的T细胞）， cytotoxic（效应T细胞）和exhausted（长期暴露于持续性抗原刺激和炎症信号后逐渐失去其正常的免疫功能和效应的T细胞），将CD4+ T细胞分为naïve, exhausted和 regulatory（抑制和调节免疫反应的T细胞）。. In order to further define the state of CD8 T cell and CD4 T cell, we classified CD8 T cells as naïve (positive for TCF7, IL7R, and CCR7), cytotoxic (positive for GNLY, GZMA, GZMB, and GZMH) and exhausted (positive for CTLA4, PDCD1, and HAVCR2), and CD4 T cells as naïve (positive for TCF7, IL7R, and CCR7), exhausted (positive for CTLA4, PDCD1, and HAVCR2) and regulatory (Treg cell, positive for FOXP3 and TNFRSF4), based on the expression of reported marker genes.组间细胞比例结果发现，EEC肿瘤组织中CD8+ naïve T细胞和cytotoxic T细胞比例均较健康内膜显著降低，CD4+ Treg细胞比例明显增多，提示EEC处于抑制性T细胞的免疫微环境中。

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四、总结

1. 单细胞水平上揭示子宫内膜癌特异地起源于内膜无纤毛腺上皮细胞，而非基质细胞。
2. 单细胞转录组、TCGA、组织免疫荧光层面上明确LCN2+SAA1/2+上皮细胞是主要的子宫内膜癌细胞起源，联合检测对子宫内膜癌总体生存有提示作用。
3. 单细胞层面指出子宫内膜癌处于T细胞抑制性免疫的肿瘤微环境中。