荧光定量PCR技术在分子生物学中的革命性应用

在分子生物学的广阔天地中，有一种技术以其精准和高效著称——实时荧光定量PCR（qPCR）。这项技术不仅是科研人员探索生命奥秘的利器，更是生物技术领域的一大突破。本文将带您深入了解这一技术。

生命科学领域的研究日新月异，对精确度和效率的要求也越来越高。传统的PCR技术虽然能够扩增DNA，但无法实现实时监测和定量分析。实时荧光定量PCR技术应运而生，它通过荧光标记的探针，实时监测DNA扩增过程中的荧光信号变化，从而实现对目标DNA序列的精确定量。

实时荧光定量PCR技术的核心在于荧光标记的寡核苷酸探针。这些探针分子小，与DNA结合后，其荧光特性会发生显著变化。通过监测这些变化，科研人员可以实时追踪DNA扩增的每一个步骤。

实验以检测HBV DNA 血清样本作为案例，随机抽取HBV DNA 阴性血清和阳性血清各10份进行检测。（注：cut off 值＝阴性样本结果的平均偏振光值＋10％阳性样本结果的平均偏振光值。偏振光值＞110％cut off 值为阳性，偏振光值＜90％cut off 值为阴性,  两值之间则为＋/－）

①血清处理

- 取30 μl的血清样本。

- 加入30 μl的处理液，该处理液包含10 mmol/L的Tris-HCl（pH 8.0）、1 mmol/L的EDTA和1 ml/L的NP40。

- 将混合物放入离心管中，煮沸15分钟以破坏血清中的蛋白质，使DNA释放。

- 以7,000 r/min的速度离心5分钟，以去除沉淀物。

- 吸取上清液2 μl作为PCR扩增的模板。

②PCR扩增反应和液相杂交

- 将2 μl的模板加入到28 μl的PCR反应液中。PCR反应液包括：

- 10×PCR缓冲液3 μl。

- dNTPs（各160 μmol/L）。

- 上游通用引物C1和下游通用引物C2，各3 pmol。

- 荧光标记的探针1.5 pmol。

- Taq DNA聚合酶1 U。

- 设置PCR程序：

- 初始循环：94 ℃，2分钟。

- 循环：94 ℃，5秒；60 ℃，55秒；72 ℃，45秒，共循环25次。

- 最后循环：94 ℃，5秒；45 ℃，20秒。

③探针杂交

- 取10 μl的PCR产物。

- 加入45 μl的杂交液，该液包含：

- 聚乙二醇4000，1 g/L。

- DMSO，300 ml/L。

- 6×SSC（pH 10）。

- 磷酸钠（pH 8.0），0.01 mol/L。

- EDTA（pH 8.0），1 mmol/L。

- SDS，5 g/L。

- 变性鲑鱼精DNA，100 μg/ml。

- 脱脂奶粉，5 g/L。

- 混合均匀后，在40 ℃下水浴10分钟。

④荧光偏振检测

- 使用荧光偏振检测仪检测荧光素的偏振值。

实验中，通过荧光偏振检测仪对PCR产物进行检测，记录荧光素的偏振值。通过与标准品浓度的比较，制作工作曲线，从而对目的基因进行定量分析。

实时荧光定量PCR技术的应用极为广泛，从病原体检测到基因表达分析，再到遗传病的诊断，它都能提供精确的数据支持。这项技术不仅提高了实验的效率，还极大地推动了生物医学研究的进展。

随着技术的不断进步，实时荧光定量PCR技术有望在未来实现更高的灵敏度和更广的应用范围。我们可以预见，这项技术将在个性化医疗、疾病早期诊断以及生物安全检测等领域发挥更大的作用。

实时荧光定量PCR技术以其独特的优势，已经成为现代分子生物学研究不可或缺的工具。它不仅为科研人员提供了一种全新的研究手段，更为整个生命科学领域的发展注入了新的活力。让我们期待这项技术在未来带给我们更多的惊喜和突破。