《Sci Transl Med》解读：磷酸化修饰抑制泛素化修饰！TRPML1是AKT 过度激活癌症的潜在治疗靶点

研究表明免疫治疗或放疗可诱导肿瘤细胞铁死亡；相反，铁死亡可促进肿瘤治疗的效果。靶向诱导铁死亡是极具潜力的肿瘤治疗方式。

2024 年 6 月，中山大学肿瘤防治中心邓蓉、朱孝峰团队在Science Translational Medicine（IF=15.8）上，发表“TRPML1 triggers ferroptosis defense and is a potential therapeutic target in AKT-hyperactivated cancer”的研究成果，揭示了TRPML1-ARL8B 介导的溶酶体胞吐通过抵抗铁死亡，促进 AKT 驱动的肿瘤发生和治疗耐受。

图形摘要：

Highlights如下：

1）筛靶：通过CRISPR-Cas9激活筛选，发现大量与溶酶体胞吐相关的基因，其中TRPML1表现出强烈的抗铁死亡活性。

2）功能：过表达TRPML1可以抵抗铁死亡，而敲除则增加铁死亡敏感性。TRPML1介导的铁死亡抵抗是AKT激活肿瘤的特征。

3）机制：AKT 直接磷酸化 TRPML1-S343，并抑制 TRPML1 的 K552 泛素化和蛋白酶体降解，从而促进 TRPML1 与 ARL8B 结合，触发溶酶体胞吐作用。

4）措施：通过减少细胞内亚铁和增强膜修复来增强 AKT 过度激活的癌细胞的铁死亡防御；靶向 TRPML1 的合成肽可抑制 AKT 驱动的肿瘤发生。备注：TRPML1 (Transient Receptor Potential Mucolipin 1) 是一种瞬时受体电位通道蛋白，主要在溶酶体膜上表达，与调节细胞内钙离子浓度和溶酶体功能相关。

筛靶研究：

CRISPR-Cas9全基因组转录激活文库筛选介导肿瘤铁死亡耐受的关键因子，发现TRPML1的sgRNA在铁死亡耐受细胞中显著富集。溶酶体胞吐对维持溶酶体稳态至关重要。

功能研究：

过表达TRPML1可以抑制erastin或RSL3诱导的铁死亡，而敲除则增加铁死亡敏感性。

机制研究：

（1）AKT 与TRPML1互作，磷酸化TRPML1的S343位点，增加其稳定性

第一步，筛选调控TRPML的上游分子

为了确定癌细胞中调节溶酶体胞吐的上游途径，选了一个含有644种化合物的激酶抑制剂文库进行筛选（工作量有点大），结果发现：具有抑制功能的小分子大部分是PI3K和AKT抑制剂，其中AKT抑制剂对溶酶体胞吐的抑制作用最强，活化AKT的表达则增强癌细胞中溶酶体的胞吐（图1a-c）。

第二步，确定AKT是TRPML的上游分子

过表达AKT1增加TRPML1的蛋白丰度（图1e），敲减或抑制AKT则降低TRPML1的蛋白丰度（图1f）；不影响TRPML1的mRNA表达（图1d）。表明AKT通过增加TRPML1蛋白丰度来增强溶酶体胞吐。

第三步，AKT与TRPML相互作用，磷酸化TRPML

为了探索AKT与TRPML之间的关系。内源性Co-IP分析显示，TRPML1与AKT相互作用（图1g）。另外，体外磷酸化实验发现，TRPML1在活性AKT激酶存在下很容易被磷酸化，而加入λ-磷酸酶(PPase)时，没有检测到这种磷酸化（图1h）。表明AKT可能通过调节其磷酸化来稳定TRPML1。

第四步，AKT磷酸化TRPML-S343位点

使用Scansite程序预测TRPML1中特定蛋白激酶的可能磷酸化位点，结合AKT保守修饰位点(RXRXXS/T，其中X为任意氨基酸)特征，推测TRPML1-S343可能是潜在的修饰位点（图1i）。结构预测该位点位于TRPML1的细胞质侧（图1j），进一步暗示TRPML1-S343可能是AKT的靶向修饰位点。体外激酶实验显示，活性AKT激酶增加TRPML1-WT蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸化量，但这种磷酸化在失活突变体TRPML1-S343A蛋白中被阻断【备注：磷酸化修饰，色氨酸（S）失活突变丙氨酸（A）；活化突变天冬氨酸（D）】（图1k）。表明AKT可以直接磷酸化TRPML1的Ser343位点。

第五步，AKT通过磷酸化TRPML1的Ser343位点来稳定TRPML1

蛋白质合成抑制剂环己亚胺(CHX)处理下，AKT抑制剂或AKT敲低加速了TRPML1的降解（图1l）。另外，在CHX处理后，磷酸化激活突变TRPML1-S343D蛋白增强了TRPML1的蛋白稳定性，而磷酸化失活突变TRPML1-S343A蛋白加速了TRPML1的降解（图1m）。表明AKT可以通过直接磷酸化和稳定TRPML1来促进溶酶体胞吐。

图1 AKT 稳定TRPML1 促进铁死亡抵抗（Ref. Fig 2/S8）

（2）AKT磷酸化TRPML1的Ser343位点后，通过抑制K552泛素化和TRPML1的蛋白酶体降解调控其蛋白稳定性

第一步，TRPML1是通过泛素蛋白酶体途径降解的

进一步研究表明，蛋白酶体抑制剂MG132以浓度依赖的方式增强TRPML1的蛋白丰度，而BafaA1对TRPML1没有影响，表明TRPML1是通过泛素蛋白酶体途径降解的（图2a）。

第二步，β-TrCP可能是TRPML1泛素化的主要E3连接酶

对候选的E3泛素连接酶分别进行干扰，发现只有β-TrCP缺失才调控TRPML1的积累（图2b）。Co-IP实验显示，β-TrCP过表达上调TRPML1泛素化水平，β-TrCP ΔF的失活体则不能（图2c）；此外，下调β-TrCP可降低TRPML1泛素化水平（图2d）。另外，Co-IP分析发现，K48R泛素突变体破坏了TRPML1的多泛素化，而K63R突变体则没有。此外，β-TrCP过表达后，K48相关的TRPML1泛素化增加（图2e-f）。表明TRPML1主要通过K48连接泛素化。

综上，β-TrCP可能是TRPML1泛素化的主要E3连接酶，通过lys48连接的多泛素链对TRPML1进行蛋白酶体降解。

第三步，探索S343磷酸化对K48连接的泛素化和TRPML1蛋白酶体降解的影响

Co-IP实验发现，TRPML1-S343D激活突变体抑制了TRPML1与β-TrCP的互作，而S343A失活突变体促进了这种互作（图2g）。Co-IP还发现，S343D突变体抑制TRPML1的泛素化，而S343A失活突变体增强泛素化（图2h）。另外，β-TrCP敲除延长了TRPML1-S343A的半衰期（图2i），表明S343磷酸化抑制了β-TrCP介导的K48泛素化和TRPML1的蛋白酶体降解。

第四步，确定TRPML1中哪些赖氨酸残基可能被泛素化

采用预测系统软件预测TRPML1的潜在泛素化位点，包括K55、K59、K62、K65、K219、K224、K227、K378和K552。构建野生型和潜在泛素化位点失活突变体【备注：泛素化失活突变体，赖氨酸(K)转精氨酸(R)】，进行Co-IP分析。发现K552R突变抑制了TRPML1的K48连锁泛素化（图2j），表明TRPML1 K552位点泛素化；另外，β-TrCP无法促进TRPML1-K552R泛素化（图2k）。CHX脉冲追踪实验发现外源表达的TRPML1-K552R在CHX处理后比野生型TRPML1更稳定（图2l）。

表明AKT通过直接磷酸化TRPML1的Ser343位点，抑制K552泛素化和TRPML1的蛋白酶体降解，从而增强溶酶体胞吐作用。

后续实验证实，敲除内源性TRPML1，外源表达TRPML1-WT、TRPML1-S343A、TRPML1-S343D或突变的TRPML1-K552R，发现活化的AKT增强231-TRPML1-WT细胞的溶酶体胞吐和降低铁死亡敏感性，而在TRPML1-S343A细胞中则没有（图3a）。此外，TRPML1-S343D细胞显示溶酶体胞吐增强和铁死亡敏感性降低，而溶酶体胞吐抑制剂TA可以逆转增强的溶酶体胞吐和降低的铁死亡敏感性（图3b-c）。表明AKT稳定TRPML1可促进溶酶体胞吐，进而诱导癌细胞对铁死亡的抵抗。

图2 AKT 稳定TRPML1 促进铁死亡抵抗（Ref. Fig 3/S9）

（3）TRPML1与ARL8B的结合是TRPML1介导的溶酶体胞吐和铁死亡抵抗所必需的

第一步，TRPML1与ARL8B互作

上述研究表明，TRPML1过表达促进溶酶体在质膜上的对接和溶酶体胞吐。研究显示溶酶体通过与ARL8B和微管相关的激酶结合，从核周区转移到质膜。Co-IP分析显示TRPML1与ARL8B互作（图3d-e）。表明TRPML1可能通过与ARL8B结合，增强溶酶体向细胞膜的运动和溶酶体胞外分泌。

第二步，确定TRPML1与ARL8B互作的具体位置

为了找出TRPML1与ARL8B互作的具体位置。构建一系列ARL8B截断体，进行Co-IP实验，发现N端区域(aa54-aa63)，包含单链β片结构，为负责ARL8B-TRPML1相互作用的主要区域（图3f-h）。另外，Co-IP显示，分别突变β片关键残基（54- 63个氨基酸序列中间引入三个脯氨酸）破坏了这种单链β片结构，随后取消了ARL8B与TRPML1的互作（图3i-j）。

第三步，TRPML1抑制铁死亡的作用取决于TRPML1与ARL8B的相互作用

敲除内源性ARL8B，然后恢复野生型或54-63肽突变型ARL8B表达，Co-IP分析发现，ARL8B突变消除了TRPML1与ARL8B的相互作用（图3k）。ARL8B突变抑制了基底和TRPML1介导的溶酶体向质膜的运动和溶酶体胞吐（图3l）。TRPML1过表达抑制ARL8B野生型细胞中的铁死亡和脂质过氧化，而在ARL8B突变的癌细胞中则没有（图3m）。TRPML1敲减则结果相反，而在ARL8B突变的癌细胞中则结果无变化（图3n）。表明TRPML1促进溶酶体胞吐并随后抑制铁死亡的作用取决于TRPML1与ARL8B的相互作用。

图3 TRPML1与ARL8B的结合是TRPML1介导的溶酶体胞吐和铁死亡抵抗所必需的（Ref. Fig4/S10）

结论：通过全基因组 CRISPR-Cas9 激活和激酶抑制剂库筛选，将 TRPML1 介导的溶酶体胞吐作用确定为潜在的抗铁死亡过程。功能上，TRPML1介导的铁死亡抵抗是AKT激活肿瘤的特征，抑制 AKT 驱动的肿瘤发生和癌症治疗耐药性。机制上，AKT 直接磷酸化TRPML1-S343，并抑制 TRPML1 的 K552 泛素化和蛋白酶体降解，从而促进 TRPML1 与 ARL8B 结合，触发溶酶体胞吐作用。本研究为开发新的癌症治疗手段提供了理论基础，尤其是针对AKT信号通路异常激活的癌症，具有重要的临床应用前景。