二代测序 学习笔记

第二代测序（Next-generation sequencing，NGS）又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。

一代测序为合成终止测序，

二代测序开创性的引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序（Sequencing by Synthesis）。

二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记（一般为荧光分子标记）来确定DNA的序列。

现有的技术平台主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。

基因簇协同性降低造成二代测序的读长（不超过500bp），因此，具有通量高、读长短的特点。

适合扩增子测序（例如16S、18S、ITS的可变区）。

基因组、宏基因组DNA则需要使用鸟枪法（Shotgun method）打断成小片段，测序完毕后再使用生物信息学方法进行拼接。

二代测序的过程

1、Illumina 原理：

桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像

主要步骤：

①DNA文库制备——超声打断加接头

②Flowcell——吸附流动DNA片段

③桥式PCR扩增与变性——放大信号

④测序——测序碱基转化为光学信号

优势：Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题。

劣势:它的主要测序错误来源是碱基的替换。而读长短（200bp-500bp）也让其应用有所局限。

2、Roche 454

油包水PCR + 4种dNTP车轮大战 + 检测焦磷酸水解发光

主要步骤：

①DNA文库制备——喷雾打断加接头

②乳液PCR——注水入油独立PCR

③焦磷酸测序——磁珠入孔，焦磷酸信号转化为光学信号

优势：454技术优势测序读长较长，平均可达400bp，

缺点是无法准确测量类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，可能导致结果不准确。也正是由于这一原因，454技术会在测序过程中引入插入和缺失的测序错误。

3、Ion Torrent 原理

油包水PCR + 4种dNTP车轮大战 + 微电极PH检测

主要步骤：

①DNA文库制备——喷雾打断加接头

②乳液PCR——注水入油独立PCR

③微电极pH检测——磁珠入池记录pH

优势：Ion Torrent与454相比，主要差异在测序中，Ion Torrent不需要昂贵的物理成像设备，成本相对较低体积较小，同时操作更为简单，整个上机测序可在2-3.5小时内完成（文库构建时间除外）。

劣势:在于芯片的通量并不高，非常适合小基因组和外显子验证的测序。

文库构建

文库构建即为测序片段添加接头。

无论是PCR产生的片段还是基因组鸟枪法打断的片段都具有特异性（PCR中不同样品反向引物插入了特异性的barcode，因此两端也是特异的），两端缺乏必要的引物因此混合DNA片段不能直接扩增和测序。DNA片段需要加接头修饰才能进行上机测序，这个过程称为二代测序的文库构建。

下面我们以常用的试剂盒NEBNext®Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina®为例阐述二代测序文库构建的流程及其原理，具体如下所示：

①末端修饰。目前很多PCR使用的高保真Pfu聚合酶产生的片段末端是平齐的（也即没有不配对的碱基）；鸟枪法产生的片段则是随机断裂，其末端可能是平齐的也可能是不平的。因此，建库第一步是使用Taq聚合酶补齐不平的末端，并在两个末端添加突出的碱基A，从而产生粘性末端（若使用Taq酶扩增，则无需末端修饰），产生粘性末端的片段可以添加接头（Adaptor）。

②添加接头。经过末端修饰后的PCR片段末端具有突出的A尾，而接头具有突出的T尾，可以使用连接酶将接头添加到DNA片段两端。NEB的接头为特殊的碱基U连接的环状结构（可以增强稳定性），因此连接接头后，还需要将碱基U删除从而形成“Y”形接头。这一步添加的接头主要是为了后续PCR中作为引物扩增继续添加文库index和与测序平台互补的寡核苷酸序列（此外还作为测序引物Rd1 SP/Rd2 SP），而之所以为“Y”型开叉结构，是因为每一端接头是两条不互补的序列（每一端都是Rd1 SP与Rd2 SP交错），因为连接酶没有选择性，每个接头都是只靠突出的T来与DNA连接，“Y”接头保证了每条单序列两端均为不同的测序引物，从而在后续PCR中可以连接不同的寡核苷酸序列（P5/P7），具体流程见下图。

③磁珠纯化。添加接头后的文库体系中含有聚合酶、连接酶等各种酶以及辅助物质，接头的添加也是过量的，而且由于末端的不稳定性，容易形成自连片段，鸟枪法打断的片段中也可能有大片段存在，所以需要特殊磁珠（AMPure XP Beads）纯化来去除大片段以及各种杂质，从而获得成功添加接头的文库片段。

其原理为磁珠可以通过氢键等作用力来吸附DNA片段，磁珠本身不具有片段大小选择的能力，但其储存的buffer里面含有20%的PEG 8000，PEG浓度越大则可以吸附的DNA片段越小。

因此磁珠纯化的时候要根据文库片段不同严格控制磁珠添加量（其实是PEG添加量）来实现片段选择。

④PCR扩增。添加了接头的DNA片段，可以使用与接头互补的引物来扩增。这个过程非常重要，因为目前所有片段其两端是不互补的Y形结构，不能直接进行测序；此外，片段还需要添加用于区分不同文库的特异性index，以及与测序仪芯片互补的两种寡核苷酸序列（P5/P7）。

⑤第二次磁珠纯化。PCR后需要将产物DNA片段与聚合酶等杂质分离，因此再次进行磁珠纯化，之后进行质量检测，包括DNA浓度检测、琼脂糖凝胶电泳和片段长度检测，完成建库。

测序是以单链为单位的，建库完成后的每条DNA的单链均一端连有测序引物Read1 Sequencing Primer（Rd1SP）和P5，另一端为Rd2 SP、Index（Barcode）和P7。Index用来区分不同的文库，因为测序仪一个run产生数据量巨大，由于实际情况不同，一次上机常会进行多个文库测序，因此需要加上Index来区分。

经评论区指正这里做补充说明：

在建库过程中，文库中每个DNA短片段的正链与反链都加上了P5与P7，因此建库后每个DNA片段都会扩增出两种结果（详见上面插图），如果全部上机，最终两条链都会有测序结果。因为上机测序起始是以DNA单链为单位，单链化的DNA片段进入测序仪流通池，会随机的结合在不同位置，且相互距离足够远以保证测序信号的独立读取。最终获得的测序结果会有重复的reads(反向互补也会有重复)，所以都会有去重步骤，而且测序量越大重复率会越高。

上机测序

Illumina测序技术为基于基因芯片的边合成边测序，整个平台可解剖为三个系统：

一温度控制系统，原理和普通PCR仪一样，来控制反应的进行；

二酶控制系统，通过各种酶来控制DNA合成与剪切；

三荧光信号收集系统，可以理解为分辨率极高的照相机。

在Illumina测序平台的流通池（Flow cell）表面，通过基因芯片技术交错固定了无数条寡核苷酸链（即短核苷酸链），分别为P5’(P5互补)和P7，单链化的文库DNA片段进入流通池后，包含P5或P7’的单链可以与表面的寡核苷酸基于互补配对结合，从而进入测序过程。测序具体流程如下：

①首先以寡核苷酸为引物、文库片段为模板进行DNA复制（因为文库稀释后浓度足够低，可以认为文库片段均匀的结合在流通池表面，每个片段结合的位置相距足够远，这很重要，否则测序时会导致信号叠加而不能识别）。复制完成后解链，将文库片段洗去，留在流通池表面的为与文库模板互补的DNA链。

②因为单链DNA另一端为不同的接头序列，可以与相邻的另一种寡核苷酸互补结合，之后进行“桥”式扩增（假如第一次结合的为P7，则复制完成洗脱模板后顶端可以与相邻的P5互补结合形成“桥”，并以P5为引物进行复制，完成后再次解链并与相邻不同种接头结合来进行复制，如此类推）。25-28个循环完成后，原来散布在表面的单核苷酸序列变成散布的DNA簇，这一步主要是为后续测序做准备，因为测序时单分子产生的光信号很弱，难以检测。

③“桥”式扩增后一个DNA簇都是由最初的一个文库模板复制而来，但是这时候P7上的序列与P5上的序列是分别从两端开始的，测序要保证每个片段一致性（都是正向或都是反向），因此再次解链线性化，切割并洗去P5上的DNA链，只留P7上的DNA单链。Illumina巧妙地利用了甲酰胺基嘧啶糖苷酶Fpg对8-氧鸟嘌呤糖苷8-oxo-G的选择性切断作用，在合成的引物链上加入了一个8-oxo-G，用Fpg处理，就把带8-oxo-G基团切掉，并把DNA链切断，留下一带不完整糖基的磷酸基。这个磷酸基在接下来的过程中，起到了阻止P5延伸的作用。此后的双末端测序中需要恢复3’-OH，则用脱嘌呤嘧啶内切核酸酶AP-endonuclease把带不完整糖基的那个磷酸基切掉。

④加入测序引物Read1 SP和修饰过的DNA聚合酶，则在测序引物3’端开始DNA复制。在流通池加入可逆终止荧光dNTP，其3’-OH被阻隔（糖基3’连接有叠氮基团，在链延伸时起到了阻止添加下一个dNTP作用，因此在除去阻隔前只能添加一个碱基），4种dNTP在碱基上分别连接有不同颜色的荧光基团（也可以相同颜色荧光标记，但是测序会更慢，每次只能添加一种碱基）。之后洗掉多余的dNTP，使用激光扫描，收集留在流通池表面的荧光信号（如图1-6所示）。用巯基试剂去掉3’位阻断的叠氮基团，用TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,三(2-羧乙基)膦)去掉荧光基团，进入下一个碱基的测序反应。因为每条DNA单链扩增形成的DNA簇均固定在表面，随着反应进行根据相同位置出现的荧光信号情况，就逐渐读出了改位点DNA链的序列。

⑤要保证测序的准确性，需要一个位点DNA簇的每条链同步复制，然而随着反应进行，不同链复制情况会出现差异，因此二代测序读长目前限制在300bp以内。Read1结束后，解链并洗掉测序中已经合成的部分，加入测序引物Index引物（也即Read2 SP互补的寡核苷酸），这时会继续在3’端进行复制，读出接头中Index序列，从而可以确定出每个位点的DNA属于哪个文库。

⑥为了增长测序长度，进行另一个方向测序，也即双末端测序。洗掉前面复制合成的片段，DNA单链继续在流通池表面形成桥式连接，这时要用脱嘌呤嘧啶内切核酸酶处理修复P5的3’-OH末端，加入聚合酶，则在P5末端开始DNA复制。十几个循环后，将P7上的DNA切割并洗掉。Illumina通过在P7核酸链中加入一个U碱基，用USER酶（Uracil Specific Excision Reagent，尿嘧啶链特定切断试剂）来切隔断链。这时只留下P5上的DNA链，与Read中方向相反。加入测序引物Read2 SP，进行另一端的序列读取。

二代测序的优缺点

优点： 一次能够同时得到大量的序列数据，相比于一代测序技术，通量提高了成千上万倍； 单条序列成本非常低廉。

缺点： 序列读长较短，Illumina平台最长为250-300bp，454平台也只有500bp左右。

二代测序相比一代测序大幅降低了成本，保持了较高准确性，并且大幅降低了测序时间，将一个人类基因组从3年降为1周以内，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，这也给三代测序提供了发展空间。

**三种测序平台的比较：

**简而言之：Roche 454是焦磷酸测序；lllunima Solexa是合成法测序；

ABI SOLiD是连接法测序。

就读长来看：Roche 454 > lllunima Solexa ABI SOLiD。就Reads数来看:ABI SOLiD > lllunima Solexa > Roche 454。

应用来说，Roche 454读长最长，便于拼接，因此在de novo测序方面有很大优势;ABISOLiD虽然读长很短，但是Reads 数最多，而且ABI独有的双色球编码技术，使得每个碱基都会被读取两遍，准确率很高，因此ABISOL.iD在榄测SNP、转录组测序、ChlP-Seq等方面很有优势;Illunima Solexa的读长和Reads 数均位于中间，比较适合于基因组重测序。而在实际应用中，由于Roche 454成本太高，因此 lllunima Solcxa也被较多的应用于de novo测序。

二代测序的价格

普通转录组分为真核和原核，

真核的普通转录组价格在800元左右，原核转录组会贵一些。根据不同服务公司营销策略和所在地区，价格会有上下浮动。

全转录组测序其实建立两到三个文库，对组织或细胞在某一时刻或处理条件下转录出来的所有RNA进行测序分析，包括mRNA和非编码RNA（ncRNA），目前主要研究的对象为mRNA和sRNA,lncRNA ,circRNA。价格各个地方同样有所差别，建立两个文库的全转录组测序一般价格在4000左右，三个文库在8000左右。