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影响因子：8.2

研究概述：肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌最常见的组织学亚型。目前，LUAD的诊断主要依靠病理分析和图像诊断，但存在材料获取困难、且具有侵入性等局限。血清作为临床上最常用的测试样本，具有侵入性小、易于获取和可重复的优点。适用于LUAD的诊断治疗。但是，血清标志物的敏感性和特异性还不够可靠。因此，发现有效的血清生物标志物将有助于LUAD的诊断和治疗。脂质运载蛋白2（LCN2），是一种分泌型糖蛋白，存在于多种组织和细胞类型中，在许多生理和病理过程中起介质作用。所以，作者对LCN2在LUAD中的作用进行了研究。作者基于生物信息学算法对LCN2表达与LUAD临床特征和预后的相关性进行了分析。并通过共表达基因的富集分析探究了其潜在的分子机制。并且，作者通过免疫浸润分析对LCN2在肿瘤微环境（TME）中的作用进行了阐述。并通过体外实验验证了LCN2的促癌作用。最后，作者通过进一步的临床样本分析证明了LCN2作为LUAD生物标志物的重要意义。最终证明，LCN2 作为一种致癌糖蛋白促进与免疫浸润相关的癌症进展，并且可能是 LUAD 的潜在诊断和预后标志物。

研究结果：

LUAD的LCN2在各数据库的表达

已有研究证明，LCN2在肿瘤中即可能是促癌因子也可能是抑癌因子。为了获得LCN2的表达情况，作者首先通过TIMER数据库对LCN2在33种癌症中的的表达情况进行研究。如图1A所示，与正常组织相比，胆管癌、肺腺癌、结肠癌、食管癌、肾状细胞、肝脏、直肠癌、甲状腺肿瘤和子宫内膜样肿瘤的LCN2表达上调。随后，作者在TCGA数据库中验证了LUAD的LCN2 基因表达情况。结果显示，与正常组织相比，LCN2在LUAD中上调（如图1B，C）。最后，作者通过HPA数据库获得LCN2的免疫组化（IHC）结果。与前两步结果一致，LUAD中的LCN2蛋白水平显著上调（如图1D）。这些结果表明，LCN2在LUAD中可能促进肿瘤的发生。

TCGA数据库中LCN2表达与LUAD临床特征的相关性

作者基于TCGA数据库对LCN2表达与临床特征的相关性进行了分析，以探索LCN2表达可能受哪些临床因素的影响。结果显示，LCN2在III-IV期、T3-T4期、N1-N3和M1期的表达水平明显更高（如图2）。随后，作者通过多因素logistic回归对LCN2的表达情况的影响因素进行研究。结果表明，LCN2高表达与淋巴结转移相关（如表1）。

LCN2表达与LUAD预后的相关性

作者通过Kaplan-Meier数据库对患者的总生存期（OS）和无疾病生存期（DFS）与LCN2表达水平的进行了相关性分析。结果显示，LCN2高表达，NSCLC患者的OS（如图3A）和DFS（如图3D）短，LUAD的OS（如图3B）和DFS（如图3E）也更短。然而，LCN2 表达与 LUSC 存活率之间没有相关性（如图3C和F）。作者又通过多因素COX回归分析发现，N型LUAD患者和LCN2高表达是LUAD患者独立预后危险因素（如图4A）。除此之外，作者进一步构建了基于两个危险因素的预后列线图（如图4B）。TimeROC 和 Calibration 曲线显示，预后模型在预测 LUAD 的 1 年、3 年和 5 年生存率方面具有良好的区分度和一致性（如图5A和5B）。此外，作者基于GSE68465队列进行了外部验证。结果与上述一致，证明了预后模型的良好疗效（如图5C和5D）。这表明，LCN2具有成为LUAD预后标志物的潜力，且LCN2高表达时，患者预后差。

LCN2共表达基因的功能富集分析

为了找到LCN2在LUAD发病机制中的下游靶点，作者通过对LCN2共表达基因和蛋白质的功能富集分析进行了探究，作者进行了如下分析。首先，作者通过Linkedomics数据库的功能模块获得了LUAD患者的LCN2共表达基因。其前50个与LCN2呈正相关和负相关的基因通过热图展示在图6A和6B中。随后，作者对LCN2以及其共表达基因进行GO和KEGG富集分析以展示其参与的生物过程。分析表明，上述基因主要位于核膜和细胞膜上，LCN2可能会影响细胞内信号转导，主要参与丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路（如图6C-E）。KEGG富集分析显示，上述基因主要富集于TNF信号通路（如图6F）。作者将LCN2与其相关的前10个共表达基因的相关性分析展示于图7A-J。上述结果表明，LCN2的肿瘤促进作用可能与JAK-STAT、TNF、NF-κB、HIF-1和PI3K-Akt信号通路有关。

LCN2表达与肿瘤浸润免疫细胞的关系

LCN2作为一种先天免疫蛋白，在TME中被认为是一种致癌免疫蛋白，所以作者对于LCN2在TME中的作用进行了探究。为了对LCN2在肿瘤免疫中的作用进行研究，作者基于TCGA中LUAD队列对LCN2高表达和低表达的之间免疫细胞的浸润水平进行差异表达（图8）。结果显示，在LCN2高表达组中CD8 T细胞、T细胞滤泡辅助细胞、T 调节细胞、巨噬细胞 M1 、中性粒细胞的浸润水平更高；而Tγ δ、巨噬细胞M2、休眠肥大细胞、嗜酸性粒细胞在LCN2低表达组中浸润水平更高。其他TIICs没有显示出统计学上的组间差异。

敲低LCN2后，细胞增殖、迁移和侵袭能力受到抑制

前文发现，LCN2可能会通过PI3K-Akt信号通路促进肿瘤细胞的增殖和侵袭，又有研究发现，LCN2是参与细胞增殖、迁移和侵袭的核心基因。所以，作者对LCN2在LUAD细胞增殖、迁移和侵袭的过程中发挥的作用进行了研究。首先，作者验证了LCN2在 LUAD 细胞系中在转录组和蛋白质组表达水平上的变化。PC9和H1975中LCN2 基因（如图9A）和蛋白（如图9B）的表达均显著高于BEAS-2B。随后，作者使用siRNA载体敲低了LUAD细胞系中的LCN2。与阴性对照相比，LUAD细胞系PC9（如图9C-D）和H1975（如图9E-F）中的LCN2基因和蛋白表达显著降低。

作者通过CCK-8实验检测LCN2对LUAD细胞系增殖能力的影响。检测结果表明，LCN2敲低72 h后，PC9（如图10A）和 H1975（如图10B）的增殖能力明显受到抑制。接下来，作者采用愈合试验检测LCN2敲低对细胞迁移能力的影响。如图10C-D所示，与阴性对照相比，敲除LCN2后细胞迁移速率显著降低。此外，Transwell试验表明，LCN2敲低后，LUAD细胞的侵袭能力显著减弱（如图10E）。上述研究结果表明：LCN2促进LUAD的发生，属于肿瘤促进因子。

LUAD血清中LCN2表达情况

血清作为常见的临床检测样本，在临床诊断中起着重要作用。LCN2已被证明是多种癌症患者的生物标志物，如果LUAD在血清中的诊断和预后价值能够得到证明，对LUAD的临床研究具有重要意义。所以，作者对LCN2在血清中的表达情况进行了检验。作者招募了 140 名参与者（98 名 LUAD 患者和 42 名健康对照）进行后续分析。作者首先对上述患者血清LCN2水平进行验证。LUAD患者血清中LCN2水平显著高于健康对照组（如图11A）。随后，作者分析了血清中LCN2水平与LUAD患者临床特征之间的相关性。吸烟者的血清LCN2水平显著高于未吸烟患者。然而，在性别和年龄方面没有观察到显着差异（如图11B-D）。与LUAD的I-II期相比，处于III-IV期的LUAD患者的LCN2水平明显更高（如图11E）。处于T2-T4、N1-N3和M1的患者的LCN2水平分别显著高于T1、N0和M0期（如图11F-H）。除此之外，作者通过Logistic回归分析血清LCN2的影响因素。结果显示III-IV期、淋巴结和远处转移与血清LCN2表达较高相关（如表2）。

血清LCN2对LUAD患者的诊断价值

如表5和图9A所示，LUAD的LCN2曲线下面积（AUC）为0.818，在诊断LUAD的III-IV期时尤其高（AUC=0.895）（如图12A）。此外，LCN2区分了I-II期和III-IV期LUAD患者，AUC为0.795，敏感性为86.67%，特异性为68.18%（如表3和如图12B）。当使用肿瘤标志物（CEA、CA125、CYFR21-1）区分临床分期时，其AUC分别为为0.809/0.832/0.837，敏感性为76.56%/80.95%/66.67%，特异性为81.08%/93.33%/85.71%（表6和图9C）。当将上述肿瘤标志物结合用于诊断LUAD时，LCN2+CEA、LCN2+CA125、LCN2+CYFR21–1和LCN2+CEA+CA125+CYFR21–1的AUC明显更高（如表3 和如图12D）。将肿瘤标志物结合用于诊断LUAD的效果明显高于单独使用。上述结果表明，血清LCN2 被证实为 LUAD 的诊断和预后标志物，在癌症筛查、诊断、治疗评估和预后随访中可能具有临床价值。

研究总结：

在这项研究中，作者通过生物信息学方法对LCN2在肺腺癌中的作用以及可能发生的机制进行了探究，并通过体外实验和临床样本进行了验证。作者发现，LCN2在LUAD中属于肿瘤促进因子。LCN2在LUAD中的表达显著上调，而高水平的LCN2表达与不良预后相关。这表明LCN2可能是LUAD与免疫浸润相关的重要诊断和预后生物标志物。这些发现为发展新型无创LUAD诊断方法提供了坚实的理论基础，但对于进一步研究及其机制尚需深入探索。