支架蛋白分子机制怎么做？DCAF7促进鼻咽癌顺铂耐药和转移(《Adv Sci》解读)

鼻咽癌（NPC）是一种影响头颈部的癌症。目前，化疗是局部晚期鼻咽癌（LA-NPC）患者的标准方案。然而，约10%的鼻咽癌患者出现化疗耐药，导致预后不理想。因此，阐明化疗耐药的分子机制至关重要。

2024年7月，中山大学唐玲珑和赵银团队在Adv Sci（IF=14.3）上，发表“DCAF7 Acts as A Scaffold to Recruit USP10 for G3BP1 Deubiquitylation and Facilitates Chemoresistance and Metastasis in Nasopharyngeal Carcinoma”的研究成果，发现DCAF7在体外和体内促进鼻咽癌细胞的顺铂耐药和转移。

图形摘要：

Highlights如下：

1）DCAF7表达与化疗耐药相关并预示不良预后。

2）DCAF7在体外和体内促进鼻咽癌细胞的顺铂耐药和转移。

3）机制上，DCAF7作为一种支架蛋白，促进USP10和G3BP1之间的相互作用，抑制G3BP1-Lys76中K48连接的泛素化，阻止G3BP1的降解，促进耐药和进展。

备注：应激颗粒（Stress granules，SGs）是细胞质中含有mRNA和蛋白质的无膜聚集体，能够协调细胞生长和代谢以应对环境变化，从而使细胞适应外界应激源。

临床相关性：

DCAF7高表达的NPC患者肿瘤转移率较高，生存率较低。

功能研究：

DCAF7在体内、外促进NPC细胞对顺铂耐药和转移。

机制研究：

（1）DCAF7的敲低通过增加G3BP1的k48链多泛素化来促进其降解

第一步，初步筛选出DCAF7的互作蛋白分子G3BP1

为了探索DCAF7在NPC进展中的具体机制，进行IP-MS分析（图1a）。通过STRING数据库和Cytoscape MCODE分析出6个蛋白簇，G3BP1在排名最高的簇的中心（图1b）。G3BP1是一种SG组装因子，已被证明在SG形成和癌症进展中具有重要意义。外源性和内源性Co-IP实验发现DCAF7与G3BP1相互作用（图1c）。

第二步，DCAF7抑制G3BP1蛋白的降解

已有报道称DCAF7是一种支架蛋白，可招募介导其靶蛋白降解的E3连接酶。敲低DCAF7可显著降低G3BP1蛋白的表达，而过表达DCAF7可提高G3BP1蛋白的表达（图1d-e）。此外，G3BP1的mRNA表达水平没有随着DCAF7的敲低或过表达而发生显著变化（图1f-g）。经环己亚胺(CHX)处理后，结果表明DCAF7延长了G3BP1蛋白的半衰期（图1h）。表明DCAF7抑制G3BP1蛋白的降解。

第三步，DCAF7通过泛素-蛋白酶体途径或自噬-溶酶体途径参与G3BP1的降解

为了确定G3BP1的降解途径。蛋白酶体抑制剂(MG132)或溶酶体抑制剂(氯喹：CQ)处理细胞，MG132逆转了DCAF7敲低导致的G3BP1蛋白水平下降（图1i-j），证实DCAF7介导的G3BP1降解是通过泛素-蛋白酶体途径发生的。进一步的Co-IP实验显示DCAF7的敲低增加了K48链的G3BP1泛素化（图1k）。表明DCAF7通过抑制G3BP1的K48链多泛素化而增加了G3BP1的稳定性。

（2）DCAF7招募USP10去泛素化并稳定G3BP1

第一步，确定DCAF7可与USP10相互作用

前面的结果表明DCAF7抑制G3BP1的泛素化，从而使其稳定。那么DCAF7是否可以招募一个结合伙伴，如去泛素化酶，以稳定G3BP1呢？根据之前的IP-MS结果，USP10是DCAF7潜在相互作用蛋白之一。USP10是一种泛素特异性蛋白酶，属于去泛素化酶家族，据报道与G3BP1相互作用。外源性和内源性Co-IP实验证实DCAF7可与USP10相互作用（图2a-b）。

第二步，USP10调控G3BP1的蛋白水平

敲低USP10降低G3BP1的蛋白水平，但不影响其mRNA水平，而过表达USP10导致G3BP1蛋白水平升高，但不影响其mRNA水平（图2c-f）。此外，G3BP1蛋白在usp10敲低细胞中的半衰期明显缩短（图2g），与DCAF7敲低细胞中的观察结果一致（图1h）。

第三步，DCAF7作为支架招募USP10来稳定G3BP1

确定DCAF7是否会招募USP10来稳定G3BP1。Co-IP实验发现DCAF7缺乏，明显抑制USP10和G3BP1的相互作用（图2h-i），表明这种相互作用需要DCAF7。此外，在DCAF7敲低的细胞中，USP10敲低介导的G3BP1表达下降被完全消除（图2j-k），表明DCAF7作为支架招募USP10来稳定G3BP1。

（3）DCAF7使USP10在K76处去泛素化G3BP1，最终通过泛素-蛋白酶体途径阻止G3BP1的降解

第一步，USP10的去泛素化酶活性对于G3BP1的去泛素化至关重要

进一步研究显示，MG132处理恢复了USP10敲低细胞中G3BP1的表达（图3a-b）。另外，Co-IP实验发现，USP10的过表达降低了G3BP1的泛素化，而USP10催化失活突变体（Cys424Ala;C424A）则没有这种作用（图3c），说明USP10的去泛素化酶活性对于G3BP1的去泛素化至关重要。

第二步，DCAF7使USP10在K76处去泛素化G3BP1

Co-IP实验显示，DCAF7敲低导致G3BP1泛素化显著增加（图3d-e）。据文献报道三个赖氨酸残基可作为G3BP1的潜在泛素化位点。构建G3BP1的K36R、K76R和K123R突变体进行Co-IP分析，发现K36R和K76R-G3BP1突变体的泛素化效果都不如野生型(WT) G3BP1，表明G3BP1可以在K36和K76位点泛素化（图3f）；而USP10敲除后，WT G3BP1和K36R突变体的泛素化显著增强，而K76R突变体的泛素化不受USP10敲除的影响，说明USP10主要去除G3BP1的K76多泛素链（图3f）。

进一步研究G3BP1 K76R突变体是否会影响G3BP1的稳定性。CHX处理细胞，WB实验结果显示，G3BP1的K76R突变显著增强了其蛋白稳定性（图3g）。表明DCAF7使USP10在K76处去泛素化G3BP1，最终通过泛素-蛋白酶体途径阻止G3BP1的降解。

后续的功能实验也表明G3BP1 K76R突变体显著增强了鼻咽癌细胞的顺铂耐药性以及迁移和侵袭能力（图3h-i）。

结论：该研究通过分析鼻咽癌耐药组织芯片数据，发现DCAF7在TPF耐药的NPC患者中高表达，且DCAF7高表达的NPC患者具有高转移风险和较差的预后。功能上，发现DCAF7促进NPC细胞对顺铂耐药和转移。随后通过IP-MS和Co-IP分析鉴定G3BP1和USP10是DCAF7的结合蛋白。机制上，DCAF7促进USP10与G3BP1的结合，去除G3BP1的Lys76上的K48泛素链，进而防止G3BP1通过泛素-蛋白酶体途径的降解，并促进SG样结构的形成，从而促进NPC对顺铂耐药和转移。本研究深入探究了TPF耐药在NPC患者中的发生机制，确定了NPC的潜在治疗靶点，为改善鼻咽癌治疗策略提供理论基础。