核酸提取方法及原理

核酸提取纯化的原则与要求：

保证核酸一级结构的完整性；

排除其他核酸分子的污染干扰（提取DNA时排除RNA干扰）；

核酸样品中不应有对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度金属离子；

尽量将样品中其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染降低到最低水平。

核酸提取的基本步骤：

核酸提取常见方法：

1. 苯酚氯仿抽提法

核酸提取的经典方法。通过苯酚氯仿处理细胞破碎液或者组织匀浆后，在水相中主要溶解的是以DNA为主的核酸成分，在有机相中主要是多糖和脂类物质，蛋白质则沉淀于两相之间。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀核酸，之后再离心分离和纯化溶解即可得到高纯度核酸。

最大优势是成本低，对实验条件要求较低；提取的核酸保持天然状态；获得的核酸纯度高、片段大、效果好；缺点是操作较为繁琐。

2. 煮沸裂解法

适用于提取细菌质粒DNA。细菌染色体DNA多为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子，当加热处理样本溶液时，线粒体染色体DNA容易发生变性，而共价闭合的质粒DNA在冷却时就可恢复其天然超螺旋结构；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片会结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，此时可通过离心将两者分开，回收上清液中的质粒DNA。

煮沸裂解法提取DNA，得量少，杂质多，DNA可能会出现断裂，主要适用于一些粗略的实验。

原理：Chelex100是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，起着螯合基团作用，对多价金属离子有极强亲和力。在低离子强度、碱性及100℃煮沸条件下，可以使细胞膜裂解，并使与DNA结合的蛋白质变性，DNA游离。检材基质中一般含有大量金属离子，在低离子强度及加热条件下，金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA，也可以抑制PCR反应，所以在提取DNA时，加入Chelex100，螯合了金属离子，防止了DNA降解，提高了PCR扩增成功率。

3. 碱裂解法

适应提取质粒DNA。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们的。在强碱性条件下用SDS破坏和裂解细胞，使细胞蛋白质和DNA变性，释放出质粒DNA，细胞碎片、蛋白质和线粒体DNA会形成复合物沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，离心分离，去除杂质，DNA保持在上清液中，可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

对细菌的裂解、细菌染色体DNA及蛋白质变性充分，提取的质粒DNA产量高、纯度好；但是质粒DNA如果长时间暴露在强碱性下容易发生不可逆转的变性，导致酶切困难，也不适合大质粒的抽提。

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复Ph至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，在而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

4. 离心柱法

通过特殊硅基质吸附材料，能够特定吸附DNA，而RNA和蛋白质顺利通过，然后利用高盐低PH结合核酸，低盐高PH值洗脱，通过离心分离和纯化核酸。

离心柱法操作相对简单，在市面上应用较为广泛。但是其具有样本需求量大，损失多，对于珍稀样本无能为力，同时不便于高通量、自动化操作等劣势。

5. 磁珠提取法

运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。先使用细胞裂解液裂解细胞，带有活性基团的磁性颗粒可特异性吸附从细胞中游离出来的核酸分子，而样品中的其他干扰物则很好的移除了，在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开完成，最后回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱即可得到纯净的DNA，获得质量较高的核酸模板。

磁珠法不需要离心、无需加入多种试剂，操作简单，符合核酸自动化提取要求。但是成本较高，科研端使用很难普及。

来源：换个视角认识“核酸”——核酸提取方法及原理 - 点成生物 (dichbio.com)

TRIS：TRIS即三羟甲基氨基甲烷，PH缓冲范围：7.0-9.0，能够维持待提取样品裂解后释放的核酸的稳定性，以避免核酸的降解，提高核酸的浓度和纯度。

EDTA：EDTA即乙二胺四乙酸，其能够与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等金属离子结合，可防止金属离子激活蛋白酶，从而减少金属离子对核酸质量的影响。

盐酸胍：是核酸酶的强抑制剂，利于从富含RNASE的组织提取完整的RNA。盐酸胍不仅能够快速的破坏细胞膜，还能够变性蛋白质，使得蛋白质变性沉淀，从而让核酸能够摆脱蛋白质的缠绕。

SDS：十二烷基硫酸钠（有机化合物），SDS作为蛋白质的变性剂和助溶性试剂，它能破坏分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质的二级和三级结构，几乎所有的蛋白质可以溶解在SDS中。SDS也可以作为去垢剂有效促进一些脂溶性物质的溶解。SDS易溶于水，但其溶解度对温度敏感，低温时SDS容易从溶液中析出。常配制成10%的储备液。