理想的质粒载体需具备哪些条件？

第一个基因克隆实验是用天然质粒DNA 分子完成的。然而尽管天然质粒在基因重组等 方面作出了贡献，但却不尽如人意，总具有这样或那样的缺陷，因而其并不适合直接用为基 因工程的载体。实践中，绝大多数质粒载体都是在天然质粒的基础上，利用重组DNA 技术 经过人工改造和组建而形成的。

作为基因工程理想的质粒载体必须具备以下几个条件 ：

(1)具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。这是质粒自我增殖所必不可少的基本条 件，也是决定质粒拷贝数的重要元件。在一般情况下， 一个质粒只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子。穿梭质粒含有两个复制子， 一个是原核生物复制子、另一个为真核生 物复制子，以确保其在两类细胞中均能得到扩增。

(2)带有尽可能多的单一限制性酶切位点，以供外源 DNA 片段定点插入。为了便于多种类型末端的DNA 片段的克隆，在质粒克隆载体上组装一个含有多种限制性核酸内切酶识 别序列的多克隆位点 (MCS)。

(3)具有合适的选择标记基因，为宿主细胞提供易于检测的表型特征。 一种理想的质粒克隆载体应该具有两种选择标记基因，并且在选择标记基因内有合适的克隆位点。当外源 DNA片段插入克隆位点，标记基因失活，成为选择重组质粒的依据。常用的选择标记基因 主要是抗生素的抗性基因[如四环素抗性、氨苄青霉素抗性 、 卡那霉素抗性、氯霉素抗性 、链霉素抗性等]和β半乳糖苷酶基因。

(4)具有较小的分子量和较高的拷贝数。小分子量的质粒容易操作，而且转化率高。当 质粒大于15kb 时，将成为转化效率的制约因素。小分子量的质粒还意味着可承载较大的外 源 DNA 片段。此外，对任何一种内切酶来说，小分子量的质粒，其多酶切位点的可能性 小。质粒具有较高的拷贝数不仅有利于质粒DNA 的制备，而且还会给克隆基因提供剂量效应。