顶刊精读 | 张泽民院士团队最新文章，时空单细胞解析免疫疗法反应下的癌症细胞动态

Basic Information

• 英文标题： Spatiotemporal single-cell analysis decodes cellular dynamics underlying different responses to immunotherapy in colorectal cancer
• 中文标题：空间时间单细胞分析解读了结肠直肠癌不同对免疫疗法反应下的细胞动态
• 发表日期：NA
• 文章类型：Article
• 所属期刊：Cancer Cell
• 文章作者：Yuqing Chen | Zemin Zhang
• 文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610824002344

Highlights

Para_01

• 在PD-1阻断下的人类结直肠癌的全面跨组织单细胞景观

• 局部协调的细胞程序展现出与反应相关联的动力学特性

• 较高的基线Ttr样细胞浸润与更好的治疗反应相关

• 增加与血液相关的Ttr样细胞水平有利于提高治疗效果

Summary

Para_01

1. 为了扩大免疫检查点封锁（ICB）在结直肠癌（CRC）中的疗效，我们需要全面了解治疗反应性。
2. 在这里，我们分析了来自22名接受PD-1封锁治疗的患者的多个连续单细胞样本，以绘制CRC患者局部和全身免疫的演变。
3. 在肿瘤中，我们发现了表现出不同治疗关联的协调细胞程序。
4. 具体来说，耗竭型T细胞（Tex）或肿瘤反应样CD8+ T细胞（Ttr-like）与治疗效果密切相关，而Tex细胞在PD-1封锁后与其他多种肿瘤富集的细胞类型显示出相关比例变化。
5. 此外，我们揭示了肿瘤中血液相关的Ttr-like细胞较少耗竭的表型，并发现它们较高的丰度预示着更好的治疗结果。
6. 最后，基线时循环CD8+ T细胞中较高水平的主要组织相容性复合体（MHC）II相关特征与较好的反应相关联。
7. 我们的研究为理解新辅助PD-1封锁后CRC中时空细胞动力学提供了见解。

Graphical abstract

Keywords

• eoadjuvant immunotherapy; sequential multi-model single-cell sequencing; systemic immunity

Introduction

Para_01

1. 有效的免疫检查点封锁（ICB）为基础的人类癌症治疗方法能激发以T细胞为中心的有效抗肿瘤反应，这些反应伴随局部肿瘤微环境（TME）的重塑及全身性免疫的变化。
2. 针对结直肠癌（CRC）累积的临床试验已经证明了ICB显著的成功，特别是对于微卫星不稳定性（MSI）或错配修复（MMR）缺陷的患者。
3. 然而，大多数CRC患者表现出微卫星稳定（MSS）表型。
4. 同时，尽管高微卫星不稳定性（MSI-high）是广泛接受的预测ICB响应性的生物标志物，但并非所有MSI-high的患者都能经历持久的响应，而在一些MSS的结肠肿瘤中也观察到了病理响应。
5. 因此，对ICB治疗下的细胞和分子动态进行全面理解将有助于开发新的策略，使更广泛的CRC患者受益。

Para_02

1. 肿瘤生态系统由多种细胞类型构成，代表了一个异质性但高度有序的群体。
2. 局部肿瘤微环境(TME)中的不同细胞类型可能在治疗干预下同时受到调控，此类伴随重塑事件在多种癌症类型中已被揭示，包括乳腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌以及错配修复缺陷型结肠癌。
3. 然而，大多数研究分别调查了离散的细胞群，然后探索潜在的细胞间相互作用，缺乏对治疗干预下TME细胞成分协调或共同进化行为的系统图谱绘制。

Para_03

1. 主要地，ICB管理的作用在于恢复T细胞介导的肿瘤消除。
2. 在肿瘤浸润T细胞亚群中，肿瘤反应性CD8+ T (Ttr) 细胞因其能够特异性靶向癌细胞上的抗原而与癌症免疫疗法的有效性密切相关。
3. 越来越多的证据表明，在肿瘤微环境中，Ttr细胞代表了一系列具有不同程度分化的表型，从前体耗竭 (Texp) 到终末分化的CD8+ T细胞。
4. 在治疗前的肿瘤中，Ttr细胞通常表现出终末耗竭的表型。
5. 而有效的ICB为基础的治疗能够重新激活Ttr细胞的功能，并且与肿瘤组织中的Texp群体密切相关。
6. 对Ttr群体进行深入研究，特别是关注基线和整个治疗过程中它们的功能亚型，有可能揭示CRC患者对ICB响应的细胞机制

Para_04

1. 此外，ICB的功效可能受到周围免疫系统的影响。
2. 我们和其他人已经证明，在PD-1阻断期间，来自周围环境的招募T细胞对于加强局部肿瘤部位的Ttr池以及维持长期抗肿瘤免疫反应具有关键作用。
3. 然而，人类癌症中，在抗PD-1干预下，Ttr群体的表型如何变化，伴随它们被招募和渗透到肿瘤中的过程仍然不清楚。
4. 此外，肿瘤与周围环境之间的通讯演变尚未完全理解。
5. 尤为重要的是，这些动态如何参与对治疗反应不同的CRC患者中仍然是一个谜。
6. 我们预计，通过抗PD-1治疗后从同一患者匹配的血液和肿瘤组织样本，结合配对的转录组和T细胞受体(TCR)谱系信息，可以解决这些挑战，并激发协调全身免疫力的潜在策略。
7. 最后，周围环境与肿瘤之间的密切沟通表明，血液本身可以作为治疗相关免疫反应的可能指标

Para_05

1. 在这里，我们利用多模态单细胞RNA和TCR测序来解析接受新辅助PD-1阻断治疗的结直肠癌（CRC）患者体内治疗诱导的变化。
2. 我们在整个治疗过程中多个时间点收集了血液、邻近正常组织和肿瘤组织中的169份匹配样本。
3. 在肿瘤中，我们的长期监测和连续取样揭示了基线浸润水平与响应相关性以及不同细胞亚型的时间动态变化，并定义了不同响应状态下的协调细胞程序。
4. 此外，我们还捕捉到了Ttr样细胞群体沿周边到肿瘤浸润过程中的转录变化，并且值得注意的是，在完全缓解者中观察到血液相关的Ttr样细胞丰度更高。
5. 另外，我们发现了一个基于循环CD8+ T细胞的标志物，能够在基线状态下区分完全缓解者和部分缓解者。
6. 综上所述，我们的研究提供了在CRC中使用抗PD-1新辅助免疫疗法期间局部和全身免疫系统的大规模时空特征描述，解码了ICB响应性的细胞和分子基础，并指导了CRC免疫治疗的潜在优化策略。

Results

The dynamic single-cell cross-tissue landscape of human CRC following PD-1 blockade

PD-1阻断后人CRC的动态单细胞跨组织景观

Para_01

1. 我们追踪了接受系统性抗PD-1免疫治疗的患者及其后续必要手术的整个治疗过程（图1A和补充图S1；星号方法部分）。
2. 共招募了20名结直肠癌(CRC)患者和两名额外的十二指肠癌患者。
3. 除P02外的所有患者均接受了新辅助免疫治疗，而对于不可切除转移性CRC的P02来说，仅可行二线免疫治疗。
4. 治疗后对所有患者的临床反应进行了综合评估，这包括肿瘤大小的退缩程度和临床反应级别（图1B和1C；补充表S1）。
5. 具体而言，肿瘤退缩被量化为一个连续变量，代表治疗过程中肿瘤大小的相对减少（星号方法部分）。
6. 临床上，我们的队列包括未响应者（表现为"疾病稳定"，SD，N = 3），以及进一步分为"完全响应"（CR，N = 12）或"部分响应"（PR，N = 7）的响应者（图1B和1C）。
7. P02被归类为SD，但在随访期间去世。
8. 到目前为止，所有其他患者都还活着，其中P01的生存时间超过4年。
9. 在响应者中没有报告复发病例，表明他们具有持久的反应。
10. 值得注意的是，两名微卫星稳定性(MSS)患者达到了CR（P01和P09），而六名微卫星不稳定性(MSI)患者保持为PR（P15、P17、P19和P24）或甚至对PD-1阻断不敏感（P16和P25）。

• 图1. 新辅助抗PD-1治疗期间CRC患者的动态单细胞景观 (A) 对接受新辅助抗PD-1治疗的22名患者进行动态追踪。
• (B) 入组患者的临床特征。
• (C) 样本的代表性磁共振成像(MRI)图像。红色圆圈标记肿瘤区域。
• (D) 实验设计概览(顶部)和分析方法(底部)。
• (E) 统一流形近似与投影(UMAP)图显示了精细的细胞簇。每个细胞的主要组分身份显示在左侧的插图中。
• (F) 盒形图显示了基线比例(左)和时间动态(右)的肿瘤组织中的T细胞数量。每个点代表一名患者。采用双侧t检验(两组间)和ANOVA(三组间)。所有主要免疫细胞类型的错误发现率(FDR)进行了调整。更多信息见补充图S1和S2；补充表S1、S2和S3。

Para_01

1. 我们总共获得了169个样本，每位患者在基线时（治疗前）采样一次，在首次给药后采样一次或多次（图S1）。
2. 值得注意的是，有三位患者在四个时间点进行了采样，八位患者在三个时间点进行了采样。
3. 这样的采样安排使我们既能进行基线关联分析与疗效的关系，又能追踪治疗干预下肿瘤微环境（TME）的纵向动态变化。
4. 为了全面绘制局部和系统的动态变化，我们同时对周边血液和伴随肿瘤内镜/手术活检的邻近正常组织进行了采样（图1D）。
5. 新鲜采集的样本接受了配对的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞TCR测序（scTCR-seq）处理。

Para_02

1. 经过严格的质量控制后，获得了975,275个高质量单细胞的转录组（详细方法见星号标记的方法部分）。
2. 无监督聚类结合经典标志物注释揭示了六种主要细胞类型：T细胞、B细胞、固有淋巴细胞（ILCs）、髓系细胞、基质细胞和上皮细胞（图1E）。
3. 随后对每个主要细胞区室进行单独的子聚类，产生了91个细粒度的细胞亚群，这些细胞亚群均以其独特的表达谱以及在血液、邻近正常组织和肿瘤组织中的分布模式为特征（补充表S2和S3；星号标记的方法部分；补充图S2A和S2B）。
4. 对于每种主要和细粒度的细胞类型，计算了基础细胞丰度和细胞动态（定义为治疗后与基础水平之间的差异）（星号标记的方法部分）。
5. 在肿瘤中，我们观察到了四种主要免疫细胞类型的响应关联性存在差异。
6. 在基础状态下，响应组（完全缓解和部分缓解组）的肿瘤中T细胞浸润水平高于非响应者（疾病稳定组）（图1F），表明基础响应者的T细胞介导的免疫反应更强。
7. 值得注意的是，两位经历显著肿瘤退缩并达到完全缓解的微卫星稳定性（MSS）患者相比其他患者的T细胞比例相对较高。
8. P01的特点是具有POLE突变，而P09没有DNA修复缺陷，并且具有较低的肿瘤突变负担（TMB），每兆碱基仅有4.75个突变（补充表S1）。
9. 这些发现表明，T细胞浸润水平可以补充微卫星不稳定性（MSI）/微卫星稳定性状态，用于预测治疗效果。
10. 在其他主要免疫细胞类型的基础状态下未发现实质性的响应关联（补充图S2C）。
11. 接下来，我们研究了PD-1阻断后肿瘤组织中主要免疫细胞类型的动态变化（图1F和补充图S2D）。
12. 具体而言，髓系细胞在疾病稳定组肿瘤中的丰度出现了独特升高。
13. 对于B细胞和T细胞，在完全缓解和部分缓解者之间观察到了不同的丰度偏差。
14. PD-1阻断后，完全缓解肿瘤中的T细胞比例下降，而部分缓解肿瘤中的T细胞比例增加，而B细胞则表现出相反的趋势。
15. 综合来看，这些观察结果证明了响应者和非响应者之间，以及粗略描述的响应患者内部存在的固有细胞异质性。

Coordinated cellular programs in the tumor ecosystem

肿瘤生态系统中的协调细胞程序

Para_01

1. 对于每种组织富集的精细细胞类型，我们使用了先前提出的基于线性回归的预测指数（Pi）和治疗指数（Ti）来定量评估基线细胞丰度和细胞动力学与响应的相关性（STAR 方法；表 S3；图 S3A）。
2. 正的 Pi 或 Ti 值表明较高的基线比例或更大的动态变化分别与有利的响应相关联。
3. 较大的绝对值意味着与肿瘤消退更强的相关性。
4. 令人惊讶的是，我们在抗 PD-1 治疗后观察到了多种细胞类型的协同动力学变化（图 2A；表 S3 和 S4）。
5. 对于几种肿瘤富集的细胞类型，包括耗竭性 CD8 T 细胞（Tex，c23_CD8_Tex_LAYN），4-1BB+ 调节性 T 细胞（c13_CD4_Treg_TNFRSF9）和 c70 内皮 COL4A1 细胞，其丰度下降与有效治疗相关，这由它们的负 Ti 值揭示。
6. 而那些正常组织富集的细胞类型，包括 c05_CD4 中心记忆 T 细胞（GPR183）和 IgA 浆细胞（c46_PlasmaB_IGHA1），则显示出了相反的趋势（图 2A 和 S3B）。
7. 这些观察结果启发我们系统地检查可能在 PD-1 阻断后协同作用的潜在细胞模块。

• 图2. 展示了与响应性具有不同关联的协调性肿瘤微环境细胞程序。（A）散点图显示了每种细胞类型的时间和组织富集情况。每个点代表一种细胞类型，颜色如图1E所示。F检验。时间指数（Ti）是通过拟合治疗后肿瘤退缩率与细胞动力学之间的线性模型计算得出的，其中r²量化了这种关联。（B）肿瘤微环境中的非负矩阵分解（NMF）基细胞程序。x轴代表肿瘤微环境中的细胞类型，y轴表示每种细胞类型在每个程序中的载荷量。（C）箱形图显示了三种选定细胞程序在肿瘤中的活动动力学。中间线表示中位数，下铰链和上铰链分别代表第25百分位和第75百分位，须状线表示四分位距的1.5倍。每个点代表一个患者。双侧t检验（两组间）和方差分析（三组间）。所有NMF程序中的相同成对比较进行了FDR调整。（D）雷达图显示了每个响应性患者在不同治疗阶段选定程序的活动情况。从圆心到点的距离代表了按比例缩放的程序活动（范围从0到1）。（E）代表性多重免疫荧光染色显示次级淋巴结构（TLS）。在主视图和放大视图中，标尺分别对应500 μm和100 μm。（F）折线图显示了肿瘤样本中次级淋巴结构的面积（左）和数量（右）。每个点代表一个肿瘤样本。线条表示配对样本。双侧t检验。另见图S3；表S1、S3和S4

Para_01

1. 我们采用基于非负矩阵分解（NMF）的方法来捕捉肿瘤微环境中精细细胞亚群的协同细胞程序，并考察这些程序是否与治疗效果相关（具体方法见STAR Methods）。
2. 对于肿瘤样本，我们识别出了五个细胞程序（NMF1-5）（图2B和补充图S3C；具体方法见STAR Methods）。
3. NMF2包括类似滤泡辅助T细胞（c08_CD4_Tfh_IL6ST）、生发中心B细胞（c44_GCB_MKI67）、初始T细胞（c16_CD8_Tn_SELL）和初始B细胞（c40_NaiveB_IGHD），类似于三级淋巴结构（TLS）的传统组成部分，因此被命名为"TLS样程序"。
4. NMF5富含多种正常组织丰富的细胞类型，包括c21_CD8_Trm_XCL1、c18_CD8_Tcm_ANXA1、各种成纤维细胞和内皮细胞亚型以及IgA浆细胞（补充表S3），因此被称为"组织重建程序"，可能代表了恢复过程中重新建立的类似正常组织的微环境。
5. 最后，鉴于多种肿瘤富集细胞类型的聚集，如Tex（c23）、4-1BB+调节性T细胞（c13）、Th17（c07_CD4_Th17_CTSH）、LAMP3+树突状细胞（c60_cDC_LAMP3）和IgG+浆B细胞（c47_PlasmaB_IGHG1）（补充表S3），NMF4被标记为"肿瘤富集程序"。
6. 为了验证鉴定出的程序的稳定性和一致性，我们评估了每个细胞程序中单个肿瘤微环境细胞类型的频率变化，发现不同细胞类型在整个治疗过程中大致表现出与程序一致的比例变化趋势（补充图S3D）。
7. 此外，我们还进行了基于CellChat的细胞间相互作用分析，以探究每个程序背后的分子事件（具体方法见STAR Methods）。
8. 组织重建程序中富含细胞外基质受体介导的相互作用，而TLS样程序和肿瘤富集程序则观察到相对较强的直接细胞接触（补充图S3E）。
9. 需要进一步的研究来解码复杂的协调信号，包括程序内的交叉对话和外部因素，这些信号可能共同塑造每个细胞程序的组成。

Para_02

1. 我们随后检查了这些细胞程序是否与治疗效果有关联。
2. 每个样本都被分配了一个对应于每个细胞程序的活动评分。
3. 类似于细胞类型动态，可以通过计算基线和治疗后肿瘤样本之间的活动评分差异来评估每个程序的活动动态。
4. 值得注意的是，在不同响应状态的患者中，这些程序呈现出多样化的模式（图2C、2D、S3F和S3G）。
5. 对于TLS样程序，响应者在治疗后显示出活动性偏好的增加。
6. 我们通过多重免疫荧光染色在17名患者中证实了TLS样程序的响应者特异性增加（表S1），发现完全缓解(CR)和部分缓解(PR)患者在治疗后TLS区域和计数增加（图2E和2F）。
7. 然而，CR和PR肿瘤在组织重建程序和肿瘤富集程序方面表现出不同的动态。
8. 治疗后，CR肿瘤中观察到组织重建程序的信号更强，而肿瘤富集程序的信号较弱，这与有效根除恶性细胞以及在CR患者中重建类似正常组织的环境相协调。
9. 相比之下，PD-1阻断对PR肿瘤在这两个程序上产生了相反的影响。
10. 对每位患者的这三个程序进行时间追踪提示了相似的发现（图2D和S3G）。
11. 有趣的是，在部分响应者中，与MSI患者相比，MSS患者在基线时观察到组织重建程序的活性较高，而肿瘤富集程序的活性较低（图S3H），表明前者的肿瘤微环境中免疫反应更为受限。
12. 综合来看，这些分析支持了这样的观点：抗PD-1治疗在我队列中诱导了多个细胞类型在TME中的丰度变化趋势相似，正如我们的细胞程序所捕捉到的一样。
13. 在不同的响应组中观察到它们的动态差异可能反映了与治疗相关的抗肿瘤过程的不同维度。

Response associations of exhausted CD8+ T cells in tumors

肿瘤中耗竭的CD8+ T细胞的响应关联

Para_01

1. 在治疗过程中观察到CR组和PR组之间存在不同的动态模式，这促使我们进一步研究与抗肿瘤过程差异相关的关键细胞类型。
2. 我们主要关注肿瘤富集程序（NMF4）。
3. 在所有TME细胞类型中，Tex（c23）、内皮（c71、c70）和Th17（c07）细胞在这个程序中表现出最高的载荷，表明这些细胞类型对定义NMF4有显著贡献。
4. 此外，对于肿瘤富集程序中的每种细胞类型，我们根据它们在治疗过程中的频率变化训练了分类器来区分CR和PR患者。
5. 值得注意的是，Tex细胞显示出最高的曲线下面积（AUC）值，其次是pDC（c55）和周细胞（c81）。
6. 这一发现与Tex细胞动力学与治疗效果之间的强烈关联一致。
7. 结合Tex细胞明显表达PDCD1和其他与耗竭相关的基因的事实，包括LAYN、ENTPD1和HAVCR2，我们将研究重点缩小到了这一群体。

• 图3. 疲劳T细胞与治疗效果的相关性 (A) UMAP图显示组织富集的CD8+ T细胞亚型，排除了血液富集的亚型（血液中的Ro/e > 1）。 (B) UMAP图显示跨治疗阶段和反应组别的组织CD8+ T细胞密度。 (C和D) 散点图显示肿瘤退缩比率与基线相关性，展示了肿瘤组织中Tex频率 (C) 和基线克隆扩增水平 (D)。每个点代表一位患者。F检验。 (E和F) PD-1阻断后，由细胞丰度 (E) 和克隆扩增水平 (F) 表征的肿瘤内c23_CD8_Tex_LAYN的动力学变化。每个点代表一位患者。双侧t检验。 (G和H) 在NSCLC患者中，由细胞丰度 (G) 和克隆扩增水平 (H) 表征的终末期Tex的动力学变化。'高'和'低'分类源自原始NSCLC研究。中心线表示中位值，下铰链和上铰链分别代表第25和第75百分位数，须部分表示1.5倍四分位距。每个点代表一位患者。双侧t检验。参见补充图S4。

Para_01

1. 进一步评估了肿瘤浸润Tex细胞与临床的相关性，不仅考虑了它们在所有CD8+ T细胞中的比例，还考虑了克隆扩增程度，后者由我们先前开发的STARTRAC指标进行量化。
2. 基线时，完全缓解(CR)肿瘤中浸润的Tex细胞在CD8+ T细胞中的比例高于反应较差的肿瘤（图3B和辅助图S4B），这与基线时CR患者的CD8+ T细胞中T细胞耗竭相关基因表达较高一致（辅助图S4C至S4I）。
3. 此外，基线时的Tex细胞流行率和克隆扩增程度均与肿瘤退缩有关联（图3C和3D）。
4. 值得注意的是，4名微卫星不稳定(MSI)部分缓解(PR)患者的Tex细胞丰度与其他PR患者非常吻合。
5. P09是一名微卫星稳定(MSS)的完全缓解患者，他在所有完全缓解患者中显示出最强的Tex细胞扩增（图3D）。
6. 这些观察进一步表明，细胞组成和状态作为补充微卫星不稳定/微卫星稳定状态的可靠临床反应指标的潜力。

Para_02

1. 接下来，我们旨在探究药物治疗后 Tex 细胞的时间动态变化。
2. 虽然在术后 SD 肿瘤中检测到的 Tex 细胞丰度与基线相比仅有轻微偏差（图 3E），但我们观察到了 CR 和 PR 组之间存在不同的模式（图 3E 和 3F）。
3. 在 CR 肿瘤中，Tex 细胞通常显示出治疗后的丰度下降以及克隆扩增水平降低。
4. 然而，患者间存在着异质性的动态变化。
5. 例如，在 P20 的治疗过程中，Tex 细胞丰度经历了一个显著的升高随后大幅下降，最终的水平仍高于基线水平（图 3E）。
6. 值得注意的是，在其他几位 CR 患者的治疗过程中也观察到了类似的变化趋势，尽管幅度各不相同，这可能反映出强烈的 Tex 基础抗肿瘤免疫反应在初次给药后迅速被激发，然后随着有效清除肿瘤而减弱。
7. 对于大多数 PR 肿瘤，我们识别出 Tex 细胞频率显著增加，并伴随着强烈的克隆扩增程度（图 3E 和 3F），表明成功的治疗诱导免疫刺激。
8. 一致地，利用我们先前的非小细胞肺癌（NSCLC）数据集，尽管没有可用的 CR 或 PR 信息，但响应性肿瘤如果在基线时 Tex 比例较高，则在 PD-1 阻断后表现出此类比例的下降；而那些基线时比例较低的肿瘤则经历了显著的增加（图 3G）。
9. 进一步重新分析 NSCLC 队列中的 TCR 信息，发现了类似的克隆扩增趋势（图 3H）。
10. 简而言之，我们的动态景观展示了不同响应性肿瘤群体中 Tex 细胞进化的分级路径。

Different dynamics of tumor reactive-like CD8+ T cells during PD-1 blockade reflected the treatment efficacy

PD-1阻断期间肿瘤反应性CD8+ T细胞的不同动态反映了治疗效果

Para_01

1. 除了上述组成和表型分析之外，我们的转录组和TCR序列的平行分析使我们能够在抗PD-1治疗后在同一谱系内明确追踪表型。
2. 之前，我们提出了一种生物信息学策略，根据Tex（c23）细胞的耗竭表型和CXCL13的表达来追踪潜在的Ttr细胞克隆。
3. 这一程序在我们的队列中检索到了395个克隆，总共覆盖了来自肿瘤、血液和邻近正常组织中的8,116个类似Ttr细胞（图S5A和S5B；STAR方法部分）。
4. 然后我们将研究中的肿瘤来源的类似Ttr细胞与已确立的真实肿瘤反应性细胞进行了比较。
5. 通过使用Celltypist51并参照Caushi等人提供的数据集，我们发现研究中的大多数类似Ttr细胞被注释为"MANA特异性"（新抗原特异性）（图S5C和S5D；STAR方法部分），这表明它们与那些真实肿瘤反应性细胞具有相似的表型。
6. 值得注意的是，在不同的患者中观察到不同数量的类似Ttr细胞，并且它们在肿瘤中的频率与治疗反应显示出类似的相关性（图S5E至S5H），与Tex（c23）细胞的情况相同（图3E）。
7. 为进一步验证，我们在一个扩大的16名患者的队列中对治疗前/后的肿瘤活检样本进行了多重免疫荧光染色。
8. 蛋白质水平的证据证实了基线CR肿瘤和治疗后PR肿瘤中含有大量的CD8+ CXCL13+细胞（图4A至4C）。
9. SD肿瘤显示持续的类似Ttr细胞缺乏（图4A和S5E至S5H）。

• 图4. 在PD-1阻断下的肿瘤反应样CD8+ T细胞 (A) 肿瘤活检样本中CD3+ CD8+ CXCL13+细胞的代表性多重免疫荧光染色。箭头表示CD3+ CD8+ CXCL13+细胞。虚线框指示放大的视图。主视图和放大的视图中的标尺分别对应200 μm和20 μm。 (B) 盒形图显示CXCL13+ CD3+ CD8+细胞占CD3+细胞的比例。中心线表示中位值，下铰链和上铰链分别代表第25百分位和第75百分位，须状线表示1.5倍的四分位距。每个点代表一个肿瘤样本。双侧t检验。 (C) 折线图显示(B)中七个患者在接受治疗匹配样本时CXCL13+ CD3+ CD8+细胞比例的变化。每个点代表一个肿瘤样本。 (D) UMAP图显示所有组织类型中的Ttr样亚型（左侧）以及代表性基因的表达（右侧）。 (E) UMAP图显示不同治疗阶段Ttr样亚型的分布。 (F) 盒形图显示Texp和Text细胞占全部Ttr样细胞（顶部）及肿瘤内T细胞（底部）的比例。中心线表示中位值，下铰链和上铰链分别代表第25百分位和第75百分位，须状线表示1.5倍的四分位距。每个点代表一个患者。双侧t检验（对于所有Ttr样细胞亚群在肿瘤中的相同配对比较进行了FDR调整）及ANOVA检验（对于三个组别中的所有Ttr样细胞亚群在肿瘤中进行了FDR调整）。 (G) 饼状图显示代表性克隆（考虑所有组织类型）在不同治疗阶段的Ttr样亚型组成。参见补充图S5和S6；补充表S1。

Para_01

1. 在克隆水平上，我们追踪了个体Ttr样克隆在肿瘤组织治疗过程中的进化模式，并将肿瘤内的Ttr样克隆分为四类：(1) 新出现的克隆，在基线时未被检测到，但在后续采样时间点出现；已存在的克隆，包括 (2) 在治疗过程中相对于基线克隆大小增加的克隆；(3) 相对于(2)，克隆大小减少的缩小克隆；以及 (4) 只能在基线时检测到的消失克隆。
2. 所有类别在完全缓解(CR)和部分缓解(PR)组中均有大量识别（图S5I），这表明治疗不仅影响已存在的克隆，还招募了新成员。
3. 然而，这些类别的分布模式在CR和PR肿瘤之间存在差异，CR肿瘤中大部分由消失克隆(4)占据，而PR肿瘤则以新出现克隆(1)的广泛扩展为特征（图S5I）。
4. 这些分析进一步支持了响应性肿瘤在治疗诱导的Ttr样动态变化中存在显著差异的观点。

Para_02

1. 为了破译PD-1阻断在不同响应群体中的相关效应，我们接下来检查了所有组织类型中Ttr样群体的转录异质性。
2. 对Ttr样池进行无监督聚类识别出了六个具有独特功能状态的子群集（图4D和S6A）。
3. 与其他子群集区分的是，Ttr06代表血液富集的循环群体（图S6B）。
4. Ttr04是一个增殖群体，而Ttr05高度表达了干扰素刺激基因（图S6B）。
5. 在其他子集中，Ttr01细胞被标记为Texp，因为它们的耗竭程度最小且已建立的Texp特征活性最高（图S6B和S6C；STAR方法）。
6. Ttr02和Ttr03的特点是比其他子集表达更高的LAYN（图S6B）。
7. 值得注意的是，Ttr02特异性地高表达终末耗竭标志物（ENTPD1、TIGIT和LAG3）（图S6B），因此将其定义为终末Tex（Text）细胞。
8. 此外，我们还单独分析了来自个体患者的T细胞克隆，以证实这些Ttr样亚群共存的事实。
9. 来自PR和CR患者的十大最大Ttr样克隆包含了各种类型的Ttr样子集。
10. 值得注意的是，我们在两个群体之间以及肿瘤治疗过程中的Ttr样子集分布并不均匀（图S6D），表明PD-1阻断以响应相关的方式诱导了Ttr样群体表型的转变。

Para_03

1. 因此，我们研究了Ttr样亚群的动力学变化，以区分CR组和PR组之间的潜在差异（图4E、4F、S6E和S6F）。
2. 治疗后，在PR肿瘤中观察到Texp和Text细胞显著积累。
3. 相比之下，基线CR组中大量的Text和增殖的Tex细胞在治疗后主要被Texp细胞取代（图4E、4F、S6E和S6F）。
4. 通过追踪治疗过程中单个克隆内Ttr样亚群的分布，进一步证实了CR组与PR组之间Ttr样细胞的不同转变（图4G和S6G）。
5. 此外，我们在NSCLC队列中重新评估了Ttr样群体，观察到了GZMK+ NR4A2+ Texp比例治疗诱导动力学的类似变化（图S6H）以及单个克隆内Ttr样亚群分布的相似情况（图S6I）。
6. 综合分析表明，在有效的治疗干预下，肿瘤中的Ttr样细胞经历了群体加强。
7. 在最有利的情况下，当绝大多数肿瘤被清除时，Texp细胞不再经历终末耗竭，导致Text细胞逐渐减少，这可能是由于耗竭相关的免疫抑制信号急剧下降；然而，在部分响应的情况下，PD-1阻断促进了Texp和Text群体的积累，同时未能完全阻止向终末耗竭的过程。

Peripheral association of tumor-reactive-like CD8+ T cells under effective therapy intervention

在有效治疗干预下肿瘤反应性样CD8+ T细胞的周围关联

Para_01

1. 有效的癌症免疫疗法需要协调一致的全身性抗肿瘤免疫反应。
2. 我们通过在多个治疗阶段、不同解剖部位进行匹配的单细胞RNA测序(scRNA-seq)和单细胞T细胞受体测序(scTCR-seq)，得以建立组织富集T细胞局部变化与其相应的全身性免疫之间深入的联系。
3. 我们首先追踪了在血液中可检测到的克隆的T细胞受体(TCR)，并将来自这些克隆的肿瘤或正常组织衍生细胞定义为"与血液相关的Ttr样"细胞（图5A；STAR方法）。
4. 检查与血液相关的Ttr样克隆在组织中的分布揭示了它们在肿瘤或正常组织中的克隆大小与血液中的克隆大小之间的相关性（补充图S7A）。
5. 接下来，我们检查了治疗后与血液相关的Ttr样克隆在血液中首次可检测的时间。
6. 令人惊讶的是，这些克隆的起源贯穿了整个治疗过程，包括基线水平（图5B），尽管scTCR-seq捕获TCR的敏感性有限。
7. 这些观察进一步支持了PD-1阻断可能有助于从周围环境中招募既有的和新出现的Ttr样克隆进入肿瘤微环境的观点。

• 图5. 在PD-1阻断下的肿瘤反应样CD8+ T细胞的周围关联 (A) UMAP图显示Ttr样细胞的解剖部位（左）和血液关联（右）。
• (B) 直方图显示治疗后血液相关Ttr样克隆最早可检测到的阶段。仅显示了具有可检测治疗后血液相关Ttr样细胞的完全缓解和部分缓解患者。
• (C) 热图显示代表性标志基因在Ttr样亚群和循环非Ttr样细胞中的表达情况。
• (D) UMAP图显示PD-1阻断后Ttr样亚群的动力学变化。
• (E) 箱线图显示不同治疗阶段肿瘤中血液相关Ttr样细胞的比例。中心线表示中位值，下铰链和上铰链分别代表第25和第75百分位数，而须状线表示1.5倍的四分位距。单侧t检验。另见补充图S7。

Para_01

1. 我们的跨组织单细胞测量使我们能够追踪细胞在浸润肿瘤过程中的表型变化。
2. 我们将来源于肿瘤的Ttr样细胞（包括与血液相关和不相关的Ttr样细胞）与循环中的Ttr样细胞进行了比较，同时还将其他循环CD8+ T细胞作为额外对照。
3. 这种比较可能作为分析Ttr样群体在癌症免疫周期中纵向分化的替代方法，在人类临床样本中。
4. 循环中的Ttr样细胞表现出PDCD1的中间表达水平，随后是肿瘤中与血液相关的Ttr样细胞的更高表达水平，而与血液不相关的Ttr样细胞则表现出PDCD1的最高表达水平（图5C）。
5. 同样地，从循环中的Ttr样细胞到与血液相关的Ttr样细胞，再到与血液不相关的Ttr样细胞，耗竭标志基因的表达也逐渐增加（图5C）。
6. 我们还使用MC38-OVA小鼠模型验证了循环和来源于肿瘤的Ttr样细胞之间的表型差异，在该模型中，观察到来源于肿瘤的CD8+ T细胞中PD-1+细胞的比例更高，而在这些PD-1+ CD8+ T细胞中，较未耗竭的人群（TCF1+）在外周血中的比例更高（补充图S7B和S7C）。
7. 相比之下，与血液不相关的Ttr样细胞相比，与血液相关的Ttr样细胞中GZMK和CCL4的表达更高（图5C）。
8. 一致地，差异表达分析推断出与血液相关的Ttr样细胞表现出耗竭相关基因（如ENTPD1和LAYN）的较低表达水平，但GZMK、GZMH、CCL4和CCL4L2的表达水平较高（补充图S7D）。
9. 先前已有报道表明，GZMH+ CD8+ T细胞人群处于向终末功能障碍过渡的状态。
10. 此外，CCL4已与多种免疫细胞类型的招募有关联，且CD8+ T细胞在抗原暴露后会上调CCL4的表达。
11. 同时，与循环中的细胞相比，在来源于肿瘤的Ttr样细胞中观察到了IFNG和多个主要组织相容性复合体（MHC）II相关基因的显著高表达，其中与血液相关的Ttr样细胞显示出最高的表达水平（图5C）。
12. 因此，与血液相关的Ttr样细胞倾向于具有抗原经验但较少耗竭的表型。
13. 值得注意的是，在治疗后，与血液相关的Ttr样细胞维持了GZMK和CCL4的高表达（补充图S7E），并且这一人群的前体标志物表达更高，耗竭程度更低，超过了基线水平（补充图S7F）。
14. 综合来看，尽管存在患者间的异质性，这些观察提供了证据表明与血液相关的Ttr样细胞可能是被激活的、类似前体的细胞，代表了介导有效抗肿瘤免疫反应的肿瘤Ttr样细胞的有效增援。

Para_02

1. 我们随后通过计算不同患者肿瘤样本中血源性Ttr样细胞在所有Ttr样细胞中的比例，考察了这些细胞的响应关联。
2. 总体而言，完全缓解(CR)肿瘤的血源性Ttr样细胞比部分缓解(PR)肿瘤更丰富，贯穿整个治疗过程（图5D和S7G），特别是在基线时（p = 0.046，图5E）。
3. 值得注意的是，在某些CR病例中，这些血源性前体细胞在治疗后仍然存在，此时大部分恶性细胞已被清除，这表明PD-1阻断诱导的Ttr样细胞介导的免疫保护具有持久性。
4. 相比之下，大多数PR患者的血源性关联较弱，提示在部分缓解者中系统性的参与有限。
5. 为进一步揭示调控这些不同强化模式背后的分子和细胞机制，进行深入研究至关重要。

Peripheral T cell characteristics were indicative of response to PD-1 blockade

外周T细胞特征表明对PD-1阻断有反应

Para_01

1. 最后，我们将分析扩展到探索循环免疫细胞与新辅助抗-PD-1治疗反应之间的关联。
2. 大多数血液富集细胞亚群的细胞比例，无论是在基线时还是治疗后，仅在不同的反应组间显示出微妙的变化，并且与肿瘤大小的退缩仅有微弱的相关性（补充表 S3）。
3. 尽管如此，我们仍然检测到了某些细胞与临床反应之间的关联。
4. 例如，在基线时髓系细胞隔室中较高的c50_Mono_FCGR3A细胞比例与有利的肿瘤退缩相关联（补充图 S7H）。
5. 有趣的是，先前的研究也已经证明了单核细胞与治疗效果之间的关联。

Para_02

1. 随后我们将注意力转向CD8+ T细胞，以探索外周响应相关的信号。
2. 分析克隆状态揭示了响应者（完全缓解和部分缓解患者）与非响应者（疾病稳定患者）之间循环CD8+ T细胞克隆多样性的显著差异，其中非响应者表现出明显较低的多样性（图6A），这与他们较少的初始T细胞数量一致（补充图S7I和S7J）。
3. 此外，在将分析限制于治疗诱导扩增的CD8+ T细胞克隆时观察到了克隆计数与肿瘤退缩之间的正相关性，包括(1)新出现的克隆和(2)在治疗期间血液中克隆大小增加的克隆（图6B）。
4. 考虑到血液相关Ttr样细胞在肿瘤微环境中的响应关联，我们接下来检查了外周的Ttr样细胞（图6C）。
5. 与其它循环CD8+ T细胞相比，在循环的Ttr样群体中观察到更大的克隆大小（图6D）。
6. 然后我们研究了循环Ttr样细胞的具体表型。
7. 血液中Ttr样与非Ttr样CD8+ T细胞之间的差异表达分析表明，循环Ttr样群体表达了更高水平的某些与细胞毒性相关的基因，如GZMB和PRF1；与白细胞招募相关的基因，如CCL5；与增殖相关的基因，如MKI67；以及与抗原呈递相关的基因，如HLA-DRA和CD74（图6E和补充图S7K；补充表S5）。
8. 此外，在基线时，Ttr样群体中MHC II相关途径的富集程度高于其它循环CD8+ T细胞（图6F和补充图S7L）。
9. 然而，Ttr样群体仅占血液中CD8+ T细胞的一小部分，这限制了我们直接利用其比例来区分不同响应组的能力。

• 图6. 与CRC治疗反应相关的外周特征 (A) 盒图显示循环CD8+ T细胞的克隆多样性。中心线表示中位值，下铰链和上铰链分别代表第25百分位和第75百分位，须状线表示四分位距的1.5倍范围。每个点代表一个患者。双侧t检验。
• (B) 肿瘤退缩与循环CD8+ T细胞中扩增或新出现的克隆计数之间的相关性。每个点代表一个患者。F检验。
• (C) UMAP图显示循环CD8+ T细胞的亚型（左）和肿瘤反应性（右）。
• (D) 密度图显示循环CD8+ T细胞克隆的克隆大小分布。
• (E) 火山图显示循环CD8+ T细胞中Ttr样细胞与非Ttr样细胞之间差异表达的基因。红色点表示调整后的p值小于0.05的单个基因，双侧t检验。
• (F) 基线时循环Ttr样和非Ttr样CD8+ T细胞中富集的途径。NES，标准化富集得分。
• (G) 在我们的CRC队列（左）和一个外部HNSCC数据集（右）中预测评分的受试者工作特征（ROC）曲线。
• (H) 盒图显示我们CRC队列（左）和一个外部HNSCC数据集（右）中的基线预测评分。双侧t检验。对于HNSCC数据集，比较是在病理反应高（N=7）和中位（N=10）的患者间进行。
• (I) 盒图显示PD-1阻断后预测评分的变化。双侧t检验。
• (J) 代表性直方图显示外周CD3+ CD8+ 细胞HLA-DR的荧光强度。
• (K) 盒图显示外周CD3+ CD8+ 细胞HLA-DR的平均蛋白表达水平。每个点代表一个样本。双侧t检验。另见图S7；表S1、S3和S5。

Para_02

1. 因此，我们检查了在整个血液CD8+ T细胞库中循环Ttr样细胞提供的表型线索，并检查是否存在与反应相关的特定关联。
2. 令人惊讶的是，在基线水平上，MHC II相关基因能够有效区分CR组和PR组中的循环CD8+ T细胞，分类器达到了0.75的AUC值（图S7M）。
3. 为了获得更简洁的反应预测标志物，我们对这些MHC II相关基因使用了Lasso回归（STAR方法），将候选基因列表缩小到HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQB1和CD74。
4. 然后，我们利用这些基因构建了预测评分（STAR方法）。
5. 正如预期的那样，该预测评分能够在我们的CRC队列中更好地区分基线水平上的CR和PR组，AUC达到0.798（图6G和6H）。
6. 对于一个外部头颈鳞状细胞癌（HNSCC）数据集，AUC达到0.743来区分高反应和中等反应（图6G和6H）。
7. 这些结果表明，这一评分可能为预测PD-1阻断前的临床反应提供潜在的非侵入性方法。
8. 同时，我们跟踪了治疗过程中的循环CD8+ T细胞，并在部分反应者中观察到治疗后这一预测评分显著升高（图6I）。
9. 为了进一步证实MHC II相关特征在循环CD8+ T细胞与临床反应之间的关联，我们分析了一个附加队列的连续血液活检样本（表S1），并通过流式细胞术评估了CD8+ T细胞中HLA-DR的平均表达水平。
10. 与转录组水平发现一致，基线水平上CD8+ T细胞中HLA-DR的平均表达量在CR患者中比PR患者更高（图6J、6K和S7N），而治疗后仅在PR患者中观察到显著升高的平均表达量（图6J和6K）。
11. 最后，在部分反应者的肿瘤和血液CD8+ T细胞中观察到治疗后MHC II相关基因的平行上调（图S7O）。
12. 总之，外周具有作为响应相关信号的重要储存库的潜力，这有助于区分分级反应状态。

Discussion

Para_01

1. 我们描绘了在人类结直肠癌（CRC）患者中，针对PD-1阻断的不同临床反应所涉及的关键细胞和分子隔室的时空动态。
2. 在我们的队列中纳入了具有不同反应的微卫星稳定（MSS）CRC患者，使我们能够观察到微卫星不稳定性（MSI）和MSS患者之间在相同反应状态下的高度相似的细胞组成和转录表型。
3. 例如，P09是一名MSS完全应答者，其特征是T细胞基线浸润程度高，并且在T细胞隔室内相对扩增的耗竭性T细胞（Tex细胞）比例高。
4. 此外，该患者在接受治疗期间也遵循与其他MSI完全应答者相似的T细胞动态。
5. 这些现象突显了单细胞测量在弥合当前理解CRC患者异质性反应状态方面潜力的重要性。
6. 尽管我们的研究主要强调了完全缓解（CR）与部分缓解（PR）之间的区别，但我们队列中相对有限的疾病稳定的（SD）患者数量限制了对非应答性和原发抵抗机制的深入探索。

Para_02

1. 有效的ICB治疗引发了TME的系统性重塑。
2. 我们队列中多种细胞类型的响应相关动态高度相关，这激发了我们探索不同细胞类型在治疗过程中的模块化行为。
3. 通过基于NMF的分析，我们识别出几个与不同响应状态相关的细胞程序（图7A）。
4. 肿瘤富集程序和组织重建程序之间观察到了几乎相反的动态变化，可能代表了PD-1阻断操纵抗肿瘤反应所涉及的基本正交过程。
5. CR肿瘤在治疗过程中表现出肿瘤富集程序活性的明显下降，而组织重建程序得到增强，表明经过最佳治疗后正常组织环境的复苏。
6. 此外，探索细胞程序内各种细胞类型的协调行为可以为未来的治疗策略提供有价值的线索。
7. 例如，据报道LAMP3+树突状细胞能够招募Tex细胞和调节性T细胞，因此它相应地参与了肿瘤富集程序。
8. LAMP3+树突状细胞中包括PD-L1在内的多种共抑制配体的高表达以及该程序在部分响应者治疗后的特异性富集表明，操控这些细胞以消除相应的免疫抑制信号可能会提高治疗效果。
9. 需要进一步的功能探索来更好地理解程序内细胞类型之间的作用和相互作用。

• 图7. 在PD-1阻断下的CRC局部和全身免疫模型（A-D）在PD-1阻断下的CRC局部和全身免疫模型。
• 在局部TME中，协调的细胞程序（由虚线标记）显示了不同基线活性和不同反应组PD-1阻断后的治疗诱导变化（A）。
• 在克隆水平上，Ttr样亚型在肿瘤中显示出不同的基线富集和动态模式，以及在CR和PR组治疗后不同的血液相关性（B）。
• Ttr样细胞从血液浸润到肿瘤组织伴随表型变化（C）。
• 循环CD8+ T细胞能够在基线时区分CR和PR组（D）。

Para_02

1. 与先前的研究一致，我们的队列证实了Ttr样细胞为中心的免疫在影响PD-1阻断治疗效果中的关键作用。
2. 我们全面的结直肠癌数据从多个方面加深了当前的理解。
3. 我们证明了Ttr样细胞既包括前体细胞也包括终末分化的Tex细胞，并且Ttr样群体的普遍存在和功能状态与治疗反应有着密切的关系（图7B）。
4. 具体而言，在治疗过程中，SD肿瘤的特点是Ttr样细胞数量稀少，而两个响应组则出现了根据治疗效果分级的动力学变化。
5. CR肿瘤含有丰富的Ttr样细胞，包括基线水平的Text和Texp细胞，而在有效治疗干预下，大多数Text细胞逐渐减少，并由Texp细胞加强。
6. 同样，最近一项关于头颈鳞状细胞癌的研究报告称，终末分化Tex细胞的显著减少与病理反应相关。
7. 相比之下，虽然基线时渗透有限，但在PR肿瘤中，Texp和Text细胞在接受治疗后逐渐积累。
8. 因此，可以合理推测基线CR肿瘤具有"热"的免疫状态，引入PD-1抗体能有效地引发基于Ttr样细胞的强大抗肿瘤反应，导致恶性细胞的清除。
9. 在PR的较不利情况下，PD-1阻断促进了Ttr样群体的积累，但未能阻止它们获得耗竭表型，这可能是由于残余肿瘤抗原或其他在肿瘤微环境中未受干扰的免疫抑制信号的刺激所致

Para_03

1. 此前，我们将‘克隆替换’的概念扩展到了‘克隆复兴’，强调了在外周T细胞在PD-1阻断期间Ttr样细胞介导的免疫反应中的关键作用。
2. 在我们的队列中观察到了来自外周的新旧Ttr样克隆的增强。
3. 此外，跨组织的单细胞水平谱系追踪使得我们能够捕捉到Ttr样群体从外周浸润到肿瘤过程中表达的变化。
4. 最近，在小鼠肿瘤模型中提出了CD8+ T细胞在淋巴结和肿瘤中的两阶段启动和激活。
5. 尽管我们的研究缺乏淋巴结样本，但我们的结果揭示了PD-1阻断下人类CRC中癌症免疫周期中Ttr样群体的表型演变。
6. 重要的是，我们发现与外周的对应细胞相比，进入肿瘤组织的Ttr样细胞IFNG显著上调。
7. 此外，肿瘤中的Ttr样细胞，其TCR在外周群体中可检测到，呈现出比那些没有在外周出现的细胞更少的耗竭表型。
8. 然而，为了推广我们的发现，更大的样本量是必要的，特别是考虑到对于每个患者只能检测到数量有限的与肿瘤中的Ttr样细胞共享TCR的循环细胞。
9. 我们的采样进一步揭示了不同响应组中Ttr样细胞血液关联性的差异，完全缓解的肿瘤中观察到了更高水平的血液相关Ttr样细胞。
10. 值得注意的是，在某些完全缓解患者治疗后可以检测到循环中的Ttr样和Texp细胞，表明有效的ICB治疗后有可能持续保护防止肿瘤复发。
11. 类似的现象在外周肺癌患者中也有观察。
12. 需要进一步的研究来解析不同组织来源对PD-1阻断背景下肿瘤Ttr样池调节的影响

Para_04

1. 在我们的队列中，经过一定剂量的新辅助治疗后，大多数PR肿瘤可以进行手术切除。
2. 有趣的是，我们观察到，治疗后PR肿瘤的局部肿瘤微环境的多个方面与基线CR肿瘤相似，比如Ttr样细胞的积累和肿瘤富集程序的丰富。
3. 然而，在治疗后的PR肿瘤中检测到了边缘周边关联性，表明循环Ttr样细胞参与局部抗肿瘤反应的效果欠佳。
4. 在这种情况下，Ttr样细胞可能缺乏足够的支持，导致肿瘤消除无效，尽管前体和耗竭Ttr样细胞的局部扩增仍可能导致部分肿瘤消退。
5. 因此，推测继续对PR肿瘤使用抗PD-1治疗可能是有益的，特别是在有额外帮助促进周围Ttr样细胞招募的情况下。
6. 最后，通过分析循环Ttr样细胞的特征，我们在血液CD8+ T细胞中识别出了一个MHC II相关的特征，这能够区分部分反应者和完全反应者（图7D）。
7. 这一发现进一步突显了CD8+ T细胞全身激活在抗肿瘤免疫反应中的关键作用。
8. 有趣的是，在与治疗相关的CD8+人群中有MHC II相关基因表达升高的现象已经在肺癌、乳腺癌和HNSCC中被观察到，尽管主要是在非血液组织类型中，且特征基因并不完全相同。
9. 我们期待未来更大规模的队列研究和蛋白质水平的验证将巩固MHC II相关特征的预测能力。

Para_05

1. 总之，我们的研究为不同治疗反应状态下的抗PD-1新辅助免疫治疗后的细胞和分子动态提供了高分辨率的描绘。
2. 值得注意的是，区分完全缓解和部分缓解患者的临床和科学价值至关重要，这可能有助于实现器官保护并减轻许多患者的生理负担。
3. 尽管仍需进行功能验证和扩大样本量的研究，但我们的结果推进了当前对PD-1阻断调控下的局部和全身抗肿瘤免疫的理解。
4. 这样的资源，部分通过我们交互式的网络门户（http://crc-icb.cancer-pku.cn/）反映出来，可能为我们提供针对结直肠癌患者更有效的治疗方法的见解。

Limitations

限制条件

Para_06

1. 本研究的一个局限性在于患者队列规模有限，包括用于验证的MSS患者和PR患者，这可能妨碍得出普遍性的结论。
2. 此外，由于特定治疗方案下临床样本稀缺，本研究中的功能验证受到限制。
3. 许多结论仍然是描述性的，为了进一步将我们的发现与临床环境联系起来，深入的机制理解是必要的。
4. 虽然我们的方法已经在多种癌症类型中得到先前验证，但本研究缺乏真实肿瘤反应性T细胞的直接实验证据。
5. 考虑到现实临床环境的复杂性，未来需要前瞻性设计的研究来进一步验证。

STAR★Methods

Key resources table

关键资源表格

Resource availability

资源可用性

Lead contact

主要联系人

Para_01

1. 更多信息和资源及试剂的请求应发送至通讯作者张泽民（[email protected]），他将负责处理这些请求。

Materials availability

材料可用性

Para_01

1. 本研究未产生新的独特试剂。

Data and code availability

数据和代码的可获得性

Para_01

1. 本研究处理过的单细胞RNA测序数据可从基因表达聚类库（GEO）获得，其访问编号为GSE236581。
2. HNSCC58和NSCLC31的单细胞RNA测序数据分别可在GEO上通过访问编号GSE200996和GSE179994获取。
3. 本研究中的原始FASTQ文件依据中国规定，在基因组序列档案库下的访问编号PRJCA018173发布。
4. 用于生成本研究结果的源代码已存档于GitHub仓库https://github.com/yqq-chen/CRC_ICB中。

Experimental model and study participant details

实验模型和研究参与者详情

Human specimens

人类样本

Para_01

1. 本研究获得了北京大学研究与伦理委员会的批准，并遵守所有相关的伦理规范。所有参与者均提供了书面知情同意。
2. 本研究在北京肿瘤医院的真实世界环境下招募了二十二名接受免疫治疗的患者，其中二十一名患者接受了术前新辅助免疫治疗，一名患者（P02）在一线化疗卡培他滨联合贝伐珠单抗失败后接受了二线免疫治疗。
3. 患者的纳入标准如下：(1) 组织病理学诊断为局部晚期或转移性结肠、直肠或十二指肠腺癌；(2) 无盆腔放疗、直肠切除、免疫治疗、需抗生素治疗的系统性感染或免疫系统疾病的历史；(3) 临床评估表明适合进行抗 PD-1 免疫治疗。
4. 由于本研究的真实世界性质以及伦理考量，特别是对于条件 (3)，在我们的队列中纳入大量病情稳定（SD）的患者并不现实。
5. 因此，将 P02 这名四期患者，其不可切除的转移性肿瘤在一线化疗失败后接受了二线免疫治疗，保留于本研究中。
6. 患者在每个 21 天周期的第一天接受静脉注射 200 毫克 PD-1 抑制剂，历时 30 分钟。
7. 其中，十七名患者接受了单一 PD-1 阻断剂治疗，十名患者接受了化疗联合 PD-1 阻断剂治疗（表 S1）。

Para_02

1. iRECIST（实体肿瘤疗效评价标准）被用于可测量的主要病灶。
2. 具体而言，如果患者符合以下任一条件，则被认为达到完全缓解（CR）：(1) 最后一次结肠镜检查时没有可触及或可见的病灶，在MRI或PET/CT上没有明确的生命信号，并且癌胚抗原检测呈阴性（临床CR；这些患者可以根据潜在风险酌情选择观察等待策略，并不会接受手术。）；或(2) 新辅助治疗后的手术中，原发肿瘤部位或淋巴结未发现残留癌细胞（病理学CR），或者术后标本的病理学检查显示原发肿瘤床内剩余存活肿瘤＜10％（主要病理学反应）。
3. 相反，如果新辅助治疗后的手术中，术后标本的病理学检查显示原发肿瘤床内剩余存活肿瘤≥10％但＜50％（部分病理学缓解），则将患者归类为部分缓解（PR）。
4. 如果放射学证据表明靶病变直径减少不超过30％或增加不超过20％，且未出现新的病灶，则患者被归类为病情稳定（SD）。
5. 病理学上，该情况表现为＞50％的存活肿瘤、大量残余癌症以及缺乏纤维化，这与NCCN TRG3一致。

Para_03

1. 22名患者中，16名患者在接受治疗后肿瘤缩小至适宜大小，随后进行了旨在治愈的手术切除。
2. 4名患者（P08、P09、P11和P24）临床完全缓解后采取了观察等待策略。
3. 1名患者（P25）因个人原因拒绝手术，在最后一次随访时被归类为疾病稳定。
4. 另1名患者（P02）在手术前去世。
5. 本研究中定义的肿瘤退缩率是治疗后最大肿瘤直径的影像学减少量与基线时最大肿瘤直径的比例。

Mouse models

小鼠模型

Para_01

1. 雄性 OT-1 小鼠购自赛业生物科技（苏州）股份有限公司，并在无特定病原体环境中饲养，可以自由获取水和标准饲料。
2. 进行移植时小鼠年龄为 8 周。
3. 将 PBS 中的 MC38-OVA 细胞以每处移植 1×10^5 个细胞的数量皮下接种。
4. 当肿瘤体积达到 600 mm³ 时收集外周血和皮下肿瘤样本。

Method details

方法详情

Sample collecting and processing

样本采集与处理

Para_01

1. 根据结直肠癌临床实践指南，从肿瘤组织和至少5厘米远的匹配正常组织区域收集组织活检样本，并在每次结肠镜检查或手术时平行采集5毫升外周血样本。

Para_02

1. 对于组织样本，收集的肿瘤或邻近正常活检样本在切除后立即存放在组织储存溶液中，并置于冰上转移。
2. 样本清洗两次后，切割成大约1-2毫米立方的小块，然后收集在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基（Gibco）中，根据制造商的协议，使用gentleMACS肿瘤分离试剂盒（Miltenyi Biotec）在37°C下的转子上进行60分钟的酶解消化。
3. 消化后的细胞通过含有10% FBS的RPMI-1640培养基（Invitrogen）中的100微米SmartStrainer过滤，并以400 g离心5分钟。
4. 去除上清液后，沉淀的细胞在1毫升红细胞裂解缓冲液（TIANDZ）中重悬，并在冰上孵育1分钟进行红细胞裂解，随后用含10% FBS的RPMI-1640培养基（Invitrogen）终止反应。
5. 再次以400 g离心5分钟后，细胞沉淀会在分选缓冲液（含1% FBS的PBS）中重悬。

Para_03

1. 血液样本收集于含EDTA抗凝剂的试管中，并置于冰上保存以便转移。
2. 恢复至室温并充分混合后，使用HISTOPAQUE-1077（Sigma-Aldrich）溶液分离外周血单核细胞（PBMCs）。
3. 具体步骤如下：小心地将外周血覆盖在等体积的HISTOPAQUE-1077上，不要破坏血浆与HISTOPAQUE-1077之间的界面。
4. 在400g条件下离心30分钟后，小心地将淋巴细胞层转移到新的试管中，并用1倍磷酸盐缓冲液（PBS，Invitrogen）洗涤两次。
5. 按照上述程序裂解红细胞后，收集到的淋巴细胞再悬浮于分选缓冲液（含1%胎牛血清的PBS）中。

Single cell sorting and data generation

单细胞分选及数据生成

Para_01

1. 为了在后续文库构建前获得高质量的细胞池，从血液或组织样本中收集的单细胞悬浮液用针对7AAD（赛默飞）和CD235a（生物传奇）的抗体进行染色，用于流式细胞术分选（BD Aria III仪器）。
2. 通过选择7AAD- CD235a- 细胞，富集了活细胞，并排除了残留的红细胞。

Para_02

1. 通过显微镜手动计数，将筛选出的细胞分装至1.5毫升低吸附管（Eppendorf）中。
2. 单细胞悬浮液的浓度调整为500-1200细胞/升。
3. 对于10x Chromium单细胞5′和VDJ文库构建（10x Genomics），加载了10,000-18,000个细胞。
4. 后续步骤遵循制造商的标准协议进行。
5. 纯化的文库通过Illumina NovaSeq平台使用150碱基对双端测序进行了分析。

Para_03

1. 为了验证人类样本外周血中的MHC II相关特征，首先按照上述程序获得PBMC悬浮液。
2. 随后，使用Zombie紫色染料（Invitrogen）对细胞进行染色以区分活细胞和已标记的死细胞。
3. 用含2%胎牛血清的PBS洗涤后，细胞与人Fc阻断剂（BD）孵育10分钟，然后加入荧光素标记的抗体，并在4°C下孵育30分钟以标记细胞表面抗原。
4. CD8+ T细胞被定义为Zombie紫色-、CD45+、CD11b-、CD19-、CD3+和CD8a+的细胞。
5. 数据通过LSRFortessa（BD）收集，并使用FlowJo（BD）进行分析。

Para_04

1. 对于小鼠样本，首先按照上述程序获取组织，然后根据说明书使用红细胞裂解缓冲液处理血液样本。
2. 通过 Zombie NIR 可固定活性试剂盒（Biolegend）区分死细胞。
3. 用含2%胎牛血清的PBS洗涤后，将分离出的细胞在4°C下与抗体孵育30-60分钟以标记细胞表面抗原。
4. 对于细胞内染色，细胞先在4°C下用4%多聚甲醛固定1小时，然后在-20°C下用甲醇透化过夜。
5. 随后，在室温下用纯化的鼠抗小鼠CD16/CD32（BD）封闭细胞10分钟，并在4°C下与细胞内抗原的抗体孵育1小时。
6. 数据使用LSRFortessa（BD）收集，并使用FlowJo（BD）进行分析。

Multiplex immunofluorescence assay

多重免疫荧光测定

Para_01

1. 石蜡包埋组织被切成5微米厚的切片，并放置在载玻片上。
2. 首先在二甲苯中脱蜡，然后依次在100%（两次）、95%和70%的酒精中复水，随后使用柠檬酸缓冲液（pH 6.0）进行热诱导抗原修复及非特异性结合阻断。
3. 移除阻断缓冲液后，在室温下与一抗孵育1小时，包括兔抗人CD3抗体（Proteintech，目录号17617-1-AP，稀释比例1:1500），鼠抗人CD8抗体（CST，目录号70306，稀释比例1:400），兔抗人CXCL13抗体（Abcam，目录号ab246518，稀释比例1:1000），兔抗人CD4抗体（Abcam，目录号ab133616，稀释比例1:500），鼠抗人CD8抗体（CST，目录号70306，稀释比例1:400），以及兔抗人CD20抗体（Abcam，目录号ab78237，稀释比例1:250）。
4. 然后用1x TBST缓冲液清洗三次，并在室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育10分钟。
5. 使用稀释至1:400的酪胺信号放大工作溶液（Panovue）进行信号放大，并在室温下孵育10分钟，之后进行微波加热处理。
6. 重复上述步骤直至所有感兴趣的抗体均完成染色。
7. 最后，细胞核用DAPI染色。
8. 染色后的载玻片使用Olympus VS200进行扫描，并使用OlyVIA分析软件（版本3.3）进行分析。

scRNA-seq data processing

单细胞RNA测序数据处理

Para_01

1. 应用 Cell Ranger 单细胞工具包（版本 6.1.2）将读段与 GRCh38 人类参考基因组对齐，并生成初步的唯一分子标识符（UMI）矩阵。
2. 使用 R 软件包 Seurat（版本 4.2.1）来分析单细胞 RNA 测序数据。
3. 我们基于三个指标进行了严格的质控筛选，以剔除低质量细胞，包括总 UMI 计数、检测到的基因数目和线粒体基因 UMI 计数的比例。
4. 具体而言，剔除了（1）UMI 计数少于 600 或多于 25,000 的细胞，（2）检测到的基因数少于 600 的细胞，或（3）线粒体基因计数超过 5%（CD45- 细胞为 70%）的细胞。
5. 然后，我们采用 Seurat 实现的 NormalizeData 函数进行文库大小校正和对数转换，所得表达矩阵用于下游分析。

Dimension reduction and unsupervised clustering

降维和无监督聚类

• 待补充

scTCR-seq data processing

scTCR-seq数据处理

Para_01

1. scTCR-seq数据使用Cell Ranger工具包进行处理，该工具将读段与GRCh38人类参考基因组对齐，并组装TCR序列。
2. 随后，我们筛选出初步组装的TCR α链和β链的CDR3核酸序列，只保留那些高度可信、全长且具有活性的序列，并为每条序列分配一个有效的细胞条形码和明确的链类型。
3. 对于每个细胞，保留α链和β链UMI计数最高的那一对用于身份识别。
4. 具有相同TCR对的细胞被认为是同一克隆型。
5. 总计，57.72%（277,198/480,238）的T细胞检测到了高质量的TCR α-β对，形成了181,909种克隆型。
6. CD4+和CD8+ T细胞的克隆型大小范围分别为1至264或1496，其中有17,443种克隆型包含多于一个细胞（图S2E和S2F）。
7. 我们使用先前基于熵的STARTRAC指标来检查CD8+ T细胞的克隆扩增。
8. 我们使用R软件包Startrac（版本0.1.0）中的Startrac.run函数计算STARTRAC-expa指数。
9. 为了量化循环CD8+ T细胞的克隆多样性，我们使用R软件包entropy（版本1.3.1）中的entropy函数计算了每个血液样本中CD8+ T细胞克隆型分布的熵。

Proportion analysis

比例分析

Para_01

1. 在这项研究中，特定样本中的主要免疫细胞类型（包括T细胞、B细胞、髓系细胞和ILCs）的细胞丰度被计算为特定主要细胞类型的细胞计数与总免疫细胞计数的比例（图1F、S2C和S2D）。
2. 精细粒度的细胞亚型的细胞丰度被计算为特定样本中特定细胞亚型的细胞计数与相应的主要细胞谱系的细胞计数之比。
3. 对于Ttr-like亚型的比例，分母在图中表示（图4F、S6E和S6F）。
4. 对于采集了四个时间点的患者，来自两个"治疗中"样本的细胞被视为一个整体来计算细胞频率。
5. 一种主要细胞类型或细胞亚型在治疗后的动态变化被定义为基线样本与治疗后样本之间细胞丰度的变化。
6. Pi和Ti是根据我们先前的研究通过拟合线性模型来计算的，线性模型的两个变量分别是（1）肿瘤退缩比例，以及（2）基线细胞丰度或治疗后细胞动态变化。
7. 具体而言，我们采用了R函数lm，使用得到的r.squared来量化相关性

Differential expression analysis

差异表达分析

Para_01

1. 两个细胞群体之间的差异表达分析使用了Seurat软件包中的FindMarkers函数进行。
2. 具体来说，采用t检验来评估每个基因的显著性，并利用Benjamini–Hochberg程序对多重假设进行了校正。
3. 调整后的p值小于0.05被用来区分显著差异表达的基因。

Tissue enrichment analysis

组织富集分析

Para_01

1. 对于每种细胞亚型，我们通过计算Ro/e评估了其在血液、邻近正常组织和肿瘤组织中的分布模式，计算方法如先前所述。
2. 具体而言，Ro/e是特定组合的细胞亚型和组织的实际细胞数与预期细胞数的比例。
3. 我们使用R函数chisq.test来获取实际和预期的细胞数，输入包括细胞类型注释向量和组织向量。
4. 简而言之，当Ro/e大于1时，表明某种细胞亚型在特定组织中的出现频率高于随机预期，因此认为该细胞亚型在该组织中富集。
5. 为了进一步量化给定细胞类型在肿瘤组织与邻近正常组织之间的分布差异，我们使用Pearson残差进行计算，如先前所述，该值由仅包含这两种组织类型的细胞作为输入的chisq.test函数获得。（图2A）

NMF analysis for cellular program identification

用于细胞程序识别的NMF分析

Para_01

1. 为了识别肿瘤微环境(TME)中的细胞程序，我们首先计算了所有TME细胞类型（不包括上皮细胞）在其各自主要细胞类型中的比例，得到了每个肿瘤样本的丰度矩阵V（细胞类型×样本）。假设我们有n个样本和m种细胞类型，那么丰度矩阵将是：V属于R的m×n次幂。
2. 数学表示为：V属于R的m×n次幂点。

Para_02

1. 值得注意的是，V 中的所有元素均为非负。
2. 之前曾使用基于PCA的方法从类似的矩阵中提取细胞共变模式。
3. 在这里，我们利用NMF的加性和可解释性来从丰度矩阵V中发现细胞模块或程序。
4. 具体而言，丰度矩阵可以分解为两个非负低秩矩阵：V = WH。
5. 其中W ∈ Rᵐᵏ和H ∈ Rᵏⁿ，而k是预定义的因素数量。
6. 矩阵W中的元素wij（i = 1,...,m; j = 1,...,k）记录了细胞类型i在对应因素j上的加载量。
7. 而系数矩阵H中的元素hpq（p = 1,...,k; q = 1,...,n）反映了样本q在估计的NMF因素p上的活动得分。
8. 我们运行了R包NMF（版本0.25）中的nmf函数多次（默认为20次），以执行NMF分析。
9. 根据NMF包的参考手册建议，每次运行使用相同的种子123456，以确保多运行时的可重复性。
10. 计算了符合系数以衡量稳定性，并据此选择了5作为分解秩（图S3C）。
11. 我们将每个NMF因素视为一个细胞程序。
12. 然后对W矩阵采用单链路法和欧几里得距离进行层次聚类，以检测每个细胞程序的代表性细胞类型。
13. 每个细胞程序的活动动态被计算为每位患者治疗后与基线样本之间的活动得分变化，其中正的活动动态表示治疗后细胞程序活动增加。

Cellular interaction analysis

细胞相互作用分析

Para_01

1. 我们使用 Cellchat（版本 1.6.1）推断了每对 TME 细胞类型之间的相互作用。
2. 具体而言，我们使用了 subsetCommunication 函数来获取配体-受体矩阵，该矩阵包含了每对源-靶细胞类型之间每对配体-受体的相互作用类型信息。
3. 特定程序（NMF1-5）内的相互作用被定义为那些源细胞和靶细胞类型在同一特定细胞程序中的相互作用。
4. 不同程序间的相互作用则被定义为那些源细胞和靶细胞类型不在同一细胞程序中的相互作用。

Identification of tumor-reactive-like CD8+ T cells

识别肿瘤反应性类似的CD8+ T细胞

Para_01

1. 我们根据先前研究的程序确定了Ttr样细胞群体。简而言之，来源于肿瘤的c23_CD8_Tex_LAYN细胞被视为根细胞，它们的克隆型被用来从CD8+ T细胞（不包括肠上皮内淋巴细胞和黏膜相关不变T细胞）中检索出原始的Ttr样克隆池。
2. 为了减少无监督聚类和单细胞RNA测序数据丢失可能带来的偏差，我们在每个克隆内部对CXCL13的表达进行了平均，并排除了那些平均表达水平低的克隆。小型克隆也被排除在外。
3. 剩下的克隆被认为是潜在的Ttr样克隆，总共包含8,116个Ttr样细胞。具体来说，我们通过三个连续步骤来识别这一群体

• 根据肿瘤组织中Tex (c23)细胞的TCR序列，提取潜在的Tex谱系克隆。

• 排除大小小于等于3或CXCL13平均表达水平低于0.1的克隆。

• 从(2)中检索出在整个肿瘤、相邻正常组织和外周血中剩余的高质量克隆型的所有细胞。

Para_02

1. 为了进一步确认鉴定出的Ttr样细胞并非由大型旁观者克隆偏倚所致，我们评估了肿瘤组织内初始Ttr样细胞（来自步骤2）中耗竭相关基因的克隆水平平均表达量。
2. 首先，我们将Ttr样克隆分为优势克隆（那些大小位于前10%，且克隆大小超过44的克隆）和其他非优势克隆。
3. 值得注意的是，无论是优势还是非优势克隆组，耗竭相关基因以及CXCL13的克隆水平平均表达量均高于非Ttr样克隆（图S5B）。
4. 此外，我们没有观察到优势克隆与其他克隆之间存在明显差异。

Para_03

1. 后续对类似Ttr细胞亚群的分析遵循了上述的维度缩减和无监督聚类程序。
2. 与血液相关的类似Ttr细胞被定义为与外周血细胞共享TCR的组织来源的类似Ttr细胞。

Phenotypical mapping of tumor-reactive-like CD8 T cells

肿瘤反应样CD8 T细胞的表型映射

• 待补充

Definition of CD8+ T cell signature scores

CD8+ T细胞特征分数的定义

Para_01

1. 我们利用先前研究中非小细胞肺癌(NSCLC)T细胞的特征定义了T细胞祖细胞(Texp)评分和耗竭评分。
2. 具体而言，耗竭评分是通过HAVCR2、ENTPD1、LAYN和LAG3计算得出。
3. 上述NSCLC研究中Texp簇的差异表达基因被用来计算Texp评分。
4. 根据已发表的T细胞研究，根据PRF1、GZMB、GZMA、GZMH、NKG7和GNLY的表达水平来计算细胞毒性评分。
5. 我们通过来自GO术语"MHC II蛋白复合体"的基因定义了一个MHC II相关特征评分。
6. 所有评分都是通过Seurat函数AddModuleScore计算得出的。

Predictive score identification

预测得分识别

Para_01

1. 我们通过最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归优化了循环CD8+ T细胞中的MHC II相关特征得分，以使用较少的基因获得更高的预测能力。
2. LASSO回归能够从MHC II基因（GO术语"MHC II蛋白复合体"）中挑选出简洁的变量，从而平衡模型的可预测性和可解释性。
3. 具体而言。

• 对于每位患者，基线循环CD8+ T细胞中每个MHC II相关基因的表达被平均化，从而得到一个患者×基因的输入表达矩阵。

• 随后，基于交叉验证中最佳的准确性表现选择了最优调参的λ。对于选定的λ，每个变量（基因）都被赋予了一个系数。

• 那些具有正系数的基因（HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQB1 和 CD74）被提取作为最优变量。

• 我们将细胞级别的预测器定义为通过Seurat函数AddModuleScore使用默认参数获得的HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQB1和CD74的特征分数。值得注意的是，我们并没有直接使用回归模型来进行预测，考虑到这些学习到的系数可能在这个CRC数据集上过度拟合了。

• 最后，对于每位患者，我们将所有循环中的 CD8+ T 细胞获得的模块评分进行平均，作为患者层面的预测指标。

Quantification and Statistical analysis

量化与统计分析

Statistical analysis

统计分析

Para_01

1. 统计分析按照图例中描述的方法进行。
2. 使用皮尔逊相关系数来估算细胞亚群之间的相关性。
3. 通过单因素方差分析和带有邦费罗尼校正的学生氏t检验来确定统计学意义。

Additional resources

附加资源

Para_01

1. 可以在 http://crc-icb.cancer-pku.cn/ 进行单细胞RNA测序数据集的分析和可视化。

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