siRNA与shRNA的干扰机制有什么不同？

RNA干扰是一种能特异性、选择性破坏靶基因表达的过程。介导RNA干扰效应的方法包括化学合成的双链小干扰RNA（siRNA）、基于载体的短发夹RNA（shRNA）等。虽然siRNA和shRNA可以实现相似的功能结果，但本质上是不同的分子。

siRNA

siRNA是一种小的双链RNA分子（~21-25 nt），由Dicer酶（RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。siRNA是RISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。

具有如下特点∶1.生成需要Argonaute家族蛋白存在。2.siRNA一般是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物；植物体内也存在内源的siRNA。3. 结构上，siRNA是双链RNA。4.在作用位置上，siRNA可作用于mRNA的任何部位，并与mRNA完全互补。5.在作用方式上，siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。

siRNA介导的RNA干扰通路

在哺乳动物中，Dicer酶与双链Tat - RNA结合蛋白(TRBP)或PACT (PKR激活蛋白)相互作用，介导RNA干扰和miRNA处理。TRBP和PACT在结构上相关，但对RNA依赖性蛋白激酶(PKR)发挥相反的调节作用。

siRNA进入细胞质后，或是直接装载到RISC上，或是进入Dicer酶介导的干扰过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA 3’端12 nt的位置切割mRNA。

化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞或组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。

shRNA

shRNA是可以克隆至表达载体并表达双链siRNA的RNA分子，包括两个短反向重复序列，中间由一茎环序列分隔，形成发夹结构，由polⅢ启动子控制。相对于siRNA，shRNA在细胞核中合成，进一步加工并运输到细胞质中，然后进入RISC发挥活性。miRNA的合成与成熟研究为shRNA的合成，特别是基于miR-30的shRNA的合成提供了基础。

shRNA介导的RNA干扰通路

shRNA表达载体进入细胞质后，需要转运到细胞核中进行转录。初级转录本（Pri-shRNA）由Drosha/DGCR8复合物处理形成pre-shRNA。Pre-shRNA被运输到细胞质中，装载到Dicer/TRBP/PACT复合物上，随后被进一步加工成成熟的shRNA。成熟shRNA与含有RISC的Argonaute蛋白相关，介导mRNA的切割和降解或处理小体（P-bodies）的翻译抑制，行使RNA干扰功能。

shRNA 表达载体：

①shRNA质粒表达载体，转染细胞后转录生成shRNA，利用细胞内的Dicer酶，生成相应的siRNA，发挥RNAi作用。

②shRNA病毒表达载体，常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等，机制与质粒载体相似，但转染细胞的效率比较高。

siRNA和shRNA的区别