项目文章 | 转录组测序解析甲基化酶抑制剂调控菊花开花周期的机理

2023年1月23日，河南大学生命科学学院王子成教授组青年教师康冬茹在生物学2 区杂志BMC Plant Biology(IF=5.260)上发表了题为“Comparative analysis of the chrysanthemum transcriptome with DNA methylation inhibitors treatment and silencing MET1 lines”的研究文章。该研究从DNA甲基化酶抑制剂和MET1基因沉默两个因素角度研究DNA甲基化改变对菊花开花周期的影响，进而探究其相关机理。

 研究背景

大多数菊花是短日照植物，在菊花的光周期诱导中，DNA甲基化起到了重要的调控作用；DNA甲基化酶抑制剂5-azaC和姜黄素可以诱导菊花开花周期的改变，但其诱导机制尚不明晰；在菊花的开花诱导实验中，DNA甲基化酶相关基因的表达模式显示：CmMET1（甲基转移酶1）和CmCMT3（甲基转移酶3）呈下降趋势，CmDRM2（结构域重排甲基转移酶2）呈上调趋势，即不同DNA甲基化酶基因功能在开花诱导中发挥不同作用。本研究借助转录组测序分析5-azaC和姜黄素诱导菊花开花周期改变的基因转录表达机制，同时借助多组学差异分析，探究开花周期改变的机理。

 研究思路

 研究结果 

1.  DNA甲基化酶抑制剂处理后的菊花表型

使用5-azaC和姜黄素对不同时期的不同品系菊花进行诱导，结果发现混合处理和姜黄素可以有效降低菊花的开花率，同时MET1-RNAi转基因系菊花的生长和开花时间均长于对照组。

2. 分析各种处理对基因表达的影响

实验共设置了5组样品（AZ、JH、HH、TG和CK），每组3个重复，通过转录组测序检测相对应的基因表达情况，并设置差异比较（CK与AZ，CK与JH，CK与TG和CK与HH），检测到的差异基因情况如下所示：总体而言，处理组相对于对照组整体下调基因偏多（CK与HH组合中有150个基因下调，80个基因上调。在CK与TG比较中，分别有542个和158个基因下调和上调。同时，CK与JH组合中分别有560个和322个基因下调和上调），同时这些差异基因主要分布在5大激素相关的通路上。

针对差异基因进行注释和富集分析（KEGG和GO数据库），其中细胞进程和代谢活动在GO数据库被显著富集，次生代谢物的生物合成在KEGG数据库中被显著富集；同时DNA甲基转移酶的相关基因也整体下调，根据IPATH通路网络化针对KEGG注释结果的展示显示，5azaC处理对菊花的影响最大，可以引起多个通路的上调和下调。

3. 鉴定与甲基化转移酶相关的基因和转录因子

姜黄素和5-azaC和MET11基因沉默都与基因组中的DNA甲基化有关，对不同分组中的DEG进行提取，提取出了与DNA甲基化相关的基因，通过热图分析展示开花基因和DNA甲基化相关基因的表达差异：Mtase基因在AZ、JH和HH治疗中下调，下调在JH中最多，TG不受影响。对于DNA甲基化基因，15个单基因的表达上调，9个单基因的表达下调。EMF（胚胎花）的表达在所有处理中均下调。

DNA甲基化的调控过程中会涉及到大量的转录因子信息，因此增加了转录因子的筛选流程，本次选择了DEG中涉及到的12个转录因子家族：对照相比，AZ处理中1379个基因家族有48个基因，JH处理有882个转录因子家族有46个DEGs，转基因系700个家族有44个DEGs，HH处理中只有230个基因属于34个家族。AZ 处理对bHLH、ERF、NAC、MYB、C2H2和WRKY基因家族中多个基因的差异表达影响仍为最显著的基因数量，上调表达数大于下调表达数。与对照组相比，下调基因数量远高于上调基因，转录因子家族包括bHLH、ERF、NAC、MYB、C2H2和WRKY。经过进一步比较，大多数转录因子相关DEG被确定为下调。

4. 定量验证

根据上述的筛选流程，筛选了一部分DEG（DNA甲基化转移酶基因和开花基因）进行荧光定量鉴定，以证实测序结果的可靠性，结果显示：荧光定量PCR结果与转录组表达谱基本趋势一致。

 结果讨论

DNA甲基化酶抑制剂主要是通过抑制甲基化酶的活性，进而导致基因DNA甲基化状态和表达水平的改变；该研究使用5-azaC和姜黄素两种抑制剂处理菊花和RNAi-MET沉默等操作，探究DNA甲基化水平的改变对菊花开花周期的影响， 并借助转录组测序检测过程中发生变化的基因。植物中有四类DNA胞嘧啶甲基转移酶：甲基转移酶（MET）、结构域重排甲基转移酶（DRM）、DNA核苷酸甲基转移酶2（DNMT2）和色甲基酶（CMT，植物特有的）。结果表明，5-azaC处理后，CmMET1（维持基因组DNA甲基化状态）的表达水平在开花期降低到与RNAi系相当的水平。作为植物特异性转录因子家族，WRKY基因家族参与植物发育的多个阶段，主要包括开花和胁迫反应。WRKY12、WRKY13和WRKY71基因在拟南芥开花诱导调控网络中起重要作用。

几种开花和DNA相关的DEG在MET1中表达不同。本研究获得的DEGs为后续相关开花期调控机制的发展提供了基因资源和技术数据。

参考文献

Kang D, Khan MA, Song P, Liu Y, Wu Y, Ai P, Li Z, Wang Z. Comparative analysis of the chrysanthemum transcriptome with DNA methylation inhibitors treatment and silencing MET1 lines. BMC Plant Biol. 2023 Jan 21;23(1):47. doi: 10.1186/s12870-023-04036-x. PMID: 36670371; PMCID: PMC9862865.