染色质免疫沉淀ChIP实验指南之(6)：详细操作步骤Protocol

ChIP实验

ChIP实验成功的三大关键因素

1、交联条件的优化

组织和细胞甲醛固定交联的化学本质是蛋白和DNA交联形成可逆共价键（在核苷酸和氨基酸之间）。

所用的甲醛终浓度约为1%，而交联时间需要预实验来确定。通常的交联条件为室温10分钟。甲醛的交联反应可被加入的交联终止剂终止。交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，实验中容易丢失目的蛋白，产生假阴性。

这里以上图拟南芥为例，甲醛在组织中的有效渗透对于ChIP实验至关重要（本实验指南适用于动物样本和植物样本，此处仅以拟南芥组织直观举例。）

（A） 在交联步骤之前，植物材料漂浮在溶液表面并被小气泡覆盖；叶片的背面和正面在颜色上不同。

（B） 固定后，植株应明显浸泡在溶液中，略透明，并均匀地浸泡在交联溶液中。

2、超声或酶切后DNA片段的大小质控和优化

打断后的染色质片段的长度应主要集中在200-1000bp左右。

温馨提示：进一步的片段长度要求如下

1）如果下游衔接的是NGS二代测序，那么DNA片段长度集中在200-500 nt左右更好。

2）如果下游衔接的是荧光定量PCR，那么DNA片段长度集中在300-1000 nt左右更好。

上图为使用MNase酶切染色质后得到的DNA小片段2%琼脂糖电泳后的条带图

上图为使用超声打断染色质后得到的DNA小片段（经过不同超声条件的优化）

注意：超声打断和酶切切断的条件需要做预实验优化

1）超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。超声打断染色质的程序和时间也需要根据不同的超声仪做预实验来确定最佳条件，不然打断程度不同，得到的染色质片段大小也不同。

2）MNase酶切染色质的用量和时间也需要做预实验来确定最佳条件，不然酶切消化程度不同，得到的染色质片段大小也不同。

3、抗体与目的蛋白结合的有效性和特异性

ChIP所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时，蛋白的抗原表位可能被结合位点处其他染色质蛋白造成的空间位阻所干扰而不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体，只有其他用途的抗体时，可以先做蛋白质免疫沉淀IP检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白，再进行染色质免疫沉淀实验的检测。另外：当使用乙酰化组蛋白抗体时，需要阻止去乙酰化的发生，因此在整个染色质提取过程中，5 mM的丁酸钠有必要存在于所有的溶液中。

建议优先使用Engibody的IF0002。

特点如下：

• IF0002 (ChIP级ProteinA/G 磁珠)已经经过了BSA蛋白和单链鲑鱼精DNA的预包被处理，极大降低了实验中非特异性吸附DNA作用带来的假阳性和背景信号。

• 此磁珠偶联的Protein A和Protein G不是简单的混合在一起的，而是一个融合表达分子，将两种分子的优势集于一身，可以对实验中绝大部分种属来源的抗体都有很高的亲和力，能强力捕获常见的兔源抗体、小鼠源抗体、山羊源抗体、绵羊源抗体、人源抗体及大鼠源抗体等。

• 此磁珠从4℃中取出，需要在室温平衡30分钟方可使用，不可高速离心，不可冷冻。并且必须在充分混匀重悬后快速吸出使用，以免磁珠沉降后吸出的悬液和理论量不符。

那么有个问题

问题：当目的蛋白实在找不到合适的ChIP级抗体时，怎么办？

回答：采用ChIP级Flag/GFP单纯抗体或是ChIP级Flag/GFP羊驼纳米抗体偶联Beads

当目的蛋白实在找不到合适的抗体时，可以尝试将GFP或FLAG等标签序列融合表达在目的蛋白的N端或是C端，构建表达载体转染细胞后表达出GFP或FLAG目的蛋白，然后采用抗GFP或FLAG的ChIP级抗体（或是GFP羊驼纳米抗体偶联的beads）免疫沉淀GFP或FLAG目的蛋白，从而间接实施了目的蛋白的ChIP实验。

4、DNA结合蛋白尤其转录因子TF的磷酸化修饰的保留

通常转录因子在得到信号通路上游调控分子促成的磷酸化修饰之后，才能进入细胞核，并结合到启动子DNA元件上，因此，在制备蛋白样本时一定要注意采用适当药物或是条件促使目的细胞或组织内的转录因子进行磷酸化修饰，同时，使用蛋白磷酸酶抑制剂处理样本，尽量保留这种磷酸化修饰。

实验前准备

试剂准备

• 试剂盒中磁珠需要从4度冰箱中取出，室温平衡30分钟，切记不可冷冻。

• 4℃中存放的试剂若有白色絮状物析出为正常现象，请恢复至室温或是37℃预热即可溶解消失。

• 本文后述Protocol中每种试剂的量都是单个样本的用量，实验前需要根据自己的实验分组计算多个样本的整体用量。

样本准备

• 动物细胞：每个样本1000万个(一个15cm培养皿在细胞生长汇合至80%-90%时的细胞数量)

• 动物内脏组织：每个样本200 mg左右, 新鲜组织或超低温保存的冻存组织均可

• 植物幼嫩组织：每个样本300-500 mg左右, 新鲜组织或超低温保存的冻存组织均可

注意：样本制备中一定要使用蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂，尤其是磷酸酶抑制剂对保留目的蛋白的磷酸化状态至关重要。

实验操作步骤如下：

Step 1：样本处理——贴壁细胞、悬浮细胞、动物组织、植物组织

1.1、贴壁培养细胞和悬浮培养细胞可以直接进入下一步Step 2，无需额外处理；

1.2、植物组织和动物组织都需要在冰上置于干净培养皿中迅速用小剪刀将组织剪碎、切割成毫米级的小碎块，并转入50mL离心管中待用；

注意：剪碎组织需要在冰上操作，且时间不宜超过20分钟，以防止蛋白质降解。

Step 2：DNA-蛋白质交联并提取染色质

2.1、甲醛固定交联

注意：

对于靶蛋白为组蛋白类的ChIP实验样本，由于DNA缠绕在组蛋白上，结合较为牢固，所以这类样本无需交联，直接收集细胞或组织，然后进入下一步Step 2.2。

对于转录因子为代表的DNA和蛋白弱结合类的ChIP实验样本，则需要先进行甲醛交联，固定DNA和蛋白的复合物，步骤如下：

细胞交联

A、为了使蛋白与DNA交联，向每个含有20 mL培养基的15cm贴壁细胞培养皿或悬浮细胞培养瓶中逐滴加入540 µL的37%新鲜甲醛溶液。稍加转动培养皿使之混匀，室温放置10分钟。

※甲醛的工作终浓度为1%

※加入甲醛后，培养基的颜色会发生改变

※使用新鲜未过产品保质期的甲醛溶液

B、每个培养皿中加入2mL的10×交联终止剂，稍加转动使之混匀，室温孵育5分钟。

※加入交联终止剂后，培养基的颜色会发生改变

C、对于贴壁细胞，直接弃去培养基后用冰冷的PBS漂洗两次(10 mL/次)， 彻底吸弃PBS。对于悬浮细胞，4°C，1000 g离心5分钟，细胞沉淀用冰冷的PBS重悬漂洗两次，彻底吸弃PBS。

D、贴壁细胞每皿中加入5 mL冰冷1×PBS（需要用前加入新鲜的蛋白酶抑制剂），用细胞刮将细胞刮下并收集到一个15 mL的离心管中。再次加入3 mL冰冷1×PBS到培养皿中，将剩余的细胞也彻底刮下，然后合并到第一次刮下的5mL细胞悬液中。4°C，1000 g离心5分钟。小心吸弃上清，得到细胞沉淀，置冰上待下一步裂解提取染色质之用。

悬浮细胞也是按照上述方法收集细胞沉淀，置于冰上，待下一步裂解提取染色质之用。

组织交联

A、在前述步骤中剪碎处理好的毫米级组织块中加入20 mL 1×PBS（含有540 μL 37%甲醛，甲醛工作终浓度为1%）并重悬组织块；置于旋转混匀仪上，室温交联10-20分钟；

B、加入2 mL 10×交联终止剂，置于旋转混匀仪上，室温，终止交联反应，5分钟；

C、1000g、4℃离心5分钟，弃上清，收集沉淀；

D、加10 mL预冷1×PBS，洗涤两次沉淀，每次4℃，1000 g离心5分钟收集沉淀。

注意：对于植物组织而言，因为有细胞壁的阻隔，所以相对于动物组织更需要优化交联的时间和条件（甚至可以采用真空交联）。

2.2、细胞裂解及染色质提取

注意：根据不同靶蛋白特点选择的技术路线不同，此时的样本处于无需交联或是已经交联的状态。

开始之前：

• Kit中的Chromatin Extract Buffer中需要预冷，并在使用前加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂（需要自备）和TCEP（Kit中含有）。

• 取出并预热实验者自备的Protease Inhibitor Cocktail (必须是无EDTA的)，使用前确保它完全融化，不过更建议使用罗氏的无EDTA蛋白酶抑制剂（货号在前文自备试剂清单里），现场将其片剂溶解成25×浓缩液备用。

• 配制1 M TCEP (572mg TCEP+ 2mL dH2O)，确保TCEP固体完全溶解。一旦配制成溶液，需将 1 M TCEP 置于 -20℃下存放，此为20×浓缩液，可以短期储存备用。TCEP在Chromatin Extract Buffer中的工作终浓度为50m mol/L，根据工作终浓度来计算所取Chromatin Extract Buffer中需要加入的TCEP浓缩液的量。

• 研钵要预冷（用于植物组织样本）

• Dounce杜恩斯匀浆器要预冷（用于动物内脏组织样本，肌肉组织也可尝试研钵）

• 组织匀浆液如果含有固体杂质过多，可以使用细胞筛网进行过滤除去。 

• 对于每个细胞样本，在上一步骤中得到的细胞沉淀中加入1mL的Chromatin Extract

Buffer, 置于冰上孵育10分钟，每2分钟颠倒混匀一次。

• 对于每个动物组织样本，将上一步骤中得到的微小组织块沉淀转移到Dounce玻璃匀浆器中，加入1mL的Chromatin Extract Buffer进行充分匀浆。

• 对于每个植物组织样本，将上一步骤中得到的微小组织块沉淀转移到研钵中，加入1mL的Chromatin Extract Buffer进行充分匀浆。

Step 3：染色质片段化——超声法或酶切法

注意：

• 甲醛交联处理的样本必须采用超声法才能有效打断染色质；

• 未经过甲醛交联处理的样本可以采用超声法或酶切法切断染色质；

• ChIP-Seq 要求超声后的片段大小在200-600 bp 之间；

• ChIP-qPCR 要求超声后的片段大小在300-1000 bp 之间；

Option A: 超声随机打断法

收集上一步骤Step 2中的细胞裂解液或组织匀浆液，直接进行如下超声打断流程。

A、非接触式全自动超声波破碎仪，高功率，30秒+30秒，超声28 cycles。或接触式超声仪230W功率，工作2秒+停止5秒，总时长15 分钟左右；

B、超声处理完成后，在 4°C 下按照13,000 g 的转速离心 10 分钟，沉淀细胞碎片，将约1 mL的上清(总染色质片段混合物)转移到新的1.5 mL离心管中；

C、将得到的约1 mL总染色质片段一分为四。

具体方法：吸出1%（即10μL）到Input管（Input管会在后续步骤Step 4.8中用到），再吸出50μL 另置一管，作为酶切质控的样本。剩余的均分到Anti-target管和IgG管，每管约470μL左右。这四管样本均置于冰上，所有样本都这样处理好，准备进入下一步骤Step 4结合一抗和Protein A/G磁珠正式进行免疫沉淀。

注意：

1、超声过程中应避免样本发热，可以断断续续超声，发热可能会使靶蛋白变性。

2、片段大小随着超声时间的增加而减小，但超声处理时间过长会破坏核小体-DNA 相互作用，因此条带大小应不小于 200 bp。

Option B: 酶切法

酶切法的原理如下图所示：

这是微球菌核酸酶MNase彻底消化染色质的最终状态

注意：

实际上都消化成单个核小体并不符合ChIP实验要求，应该消化为1-5个核小体之间，200nt - 1000nt的片段长度，更准确地说是：如果下游实验是NGS二代测序，那么DNA片段长度应在200-500 nt左右。如果下游是荧光定量PCR，那么长度集中在300-1000 nt左右更好。

开始之前：预冷1×TBS

A、收集上一步骤Step 2中的细胞裂解液或组织匀浆液于1.5 mL离心管中，4℃，10000 g，离心5分钟得到染色质沉淀，吸弃上清，加入120 µL的1× Cleavage Buffer，移液器吸吹重悬。

B、每个样本管内加入1.25 μL的微球菌核酸酶MNase，移液器吸吹混匀数次，37℃孵育20分钟。每隔3-5分钟吸吹混匀一次，将染色质酶切为符合要求的小片段。

注意：不同的细胞系，将其DNA片段化成理想长度所需的MNase量有所差别，可通过预实验确定所需酶的用量和时间。

C、在每管中加入60 μL的0.5M 酶切终止剂，终止酶切反应后，每管加入820 µL的1×TBS稀释至1 mL总体积。

D、酶切后反应液在4℃，13000 g下，离心10分钟，将上清(总染色质片段混合物)转移到新的1.5 mL离心管中；

E、将得到的约1 mL总染色质片段一分为四。

具体方法：吸出1%（即10μL）到Input管（Input管会在后续步骤Step 4.8中用到），再吸出50μL另置一管，作为酶切质控的样本。剩余的均分到Anti-target管和IgG管，每管约470μL左右。这四管样本均置于冰上，所有样本都这样处理好，准备进入下一步骤Step 4结合一抗和Protein A/G磁珠正式进行免疫沉淀。

注意：

实验做到这里，是不是大家都迫不及待想把用于染色质片段化质控的那50μL样本跑个琼脂糖凝胶电泳，看看DNA片段条带的大小分布是什么样子的呢？

答案是不可以

因为这时得到的仍然是染色质片段，DNA上还有结合的蛋白（组蛋白、转录因子、DNA修复因子、染色质重塑因子等等），这样的蛋白-DNA复合物还不能直接用于琼脂糖凝胶电泳。还需要进行下面的处理流程，去除样本中的游离RNA和结合在DNA上的各种蛋白，得到纯净的DNA片段后才能用于琼脂糖凝胶电泳。

染色质片段化质控的处理方法

1、向50μL的梁色质片段样品中(来自上一步骤超声法或是酶切法中分出的专门用于质控的50μL样本)加入100μL无核酸酶的水、10μL的ChIP专用盐溶液和2μL的RNase A。涡旋震荡混匀，37°C孵育30分钟。

2、向RNase A消化后的每管样品中加入2 μL蛋白酶K。 涡旋震荡混匀，55°C孵育2个小时。

3、使用后文Step 5步骤中的DNA纯化步骤来纯化每管中的DNA片段(可选步骤)。

4、DNA样品纯化后，每个样本取10μL进行2%琼脂糖凝胶电泳以确定DNA片段大小。DNA应当被酶切或是超声打断成长度约为200-1000bp的片段(1~5个核小体长度)。

5、测定DNA浓度时，将2 μL纯化后的DNA加入到98 μL TE缓冲液中(即稀释50倍)，然后读取OD260吸收值。将OD260吸收值乘以2500即得到 以μg/mL表示的DNA浓度。理想的DNA浓度应当在100~200 μg/mL之间。

6、当电泳结果显示的片段大小处在符合实验要求的范围内，才可以进入下一步Step 4免疫沉淀实验。如果DNA片段大小不符合实验要求，则需要重新优化片段化的处理条件，直到符合要求。

温馨解惑：

为什么使用RNase A？

上述用于质控DNA片段长度的样本在蛋白酶K消化后得到游离DNA片段，可以直接用于琼脂糖凝胶电泳，也可以使用DNA纯化试剂进一步的纯化后再电泳，在DNA纯化过程中高丰度的RNA会干扰目的DNA纯化，因此需要使用 RNase A 处理样本，否则纯化步骤会被RNA干扰而导致DNA产物大大减少。同时去除RNA也可以减少对DNA琼脂糖电泳的干扰。

为什么使用蛋白酶 K？

用蛋白酶 K处理样本，可使邻近脂肪与芳香族氨基酸羧基的肽键断裂。消化结合在DNA上的蛋白质，促进 DNA 的纯化。

Step 4：染色质免疫沉淀——捕获、洗涤、洗脱并解交联蛋白质-DNA复合物

上图为两种染色质免疫沉淀复合物的微观示意图

捕获蛋白质-DNA复合物

4.1、在IP样本管（Input管不加抗体和磁珠）中按照实验的样本内分组设计分别对应加入靶蛋白的一抗或者阴性对照Normal IgG，并在室温下置于旋转混匀仪中孵育 2 小时或者4度过夜。抗体最佳用量需要通过预实验来确定，一般来说，每管样本中加入1-10 μg抗体。

4.2、在孵育了靶蛋白一抗的Anti-target样本管和孵育了阴性对照IgG的IgG样本管中均加入ChIP级Protein A/G 磁珠，每管中加入40μL的Protein A/G 磁珠，用于抓取抗体染色质复合物，室温孵育2小时。孵育时可以置于旋转混匀仪中。

注意：

• ChIP级Protein A/G 磁珠已经经过了单链鲑鱼精DNA的预包被处理，极大降低了实验中非特异性吸附DNA作用带来的假阳性。

• 此磁珠是Protein A和Protein G的融合表达分子，将两种分子的优势集于一身，可以对实验中绝大部分种属来源的抗体都有很高的亲和力，能强力捕获常见的兔源抗体、小鼠源抗体、山羊源抗体、绵羊源抗体、人源抗体及大鼠源抗体等。

• 此磁珠从4℃中取出，需要在室温平衡30分钟方可使用，不可高速离心，不可冷冻。并且需要在充分混匀重悬后立即快速吸出使用，以免磁珠沉降后吸出的悬液和理论量不符。

• 阴性对照Normal

IgG必须要和靶蛋白的一抗是同一种种属来源，例如靶蛋白一抗是兔单抗，那么Normal IgG应该选择Rabbit normal IgG，并且用量相同。

 

洗涤蛋白质-DNA复合物

开始之前：

将ChIP Wash Buffer 1，ChIP Wash Buffer 2，ChIP Wash Buffer 3，ChIP Wash Buffer 4全部置冰上预冷备用。 

4.3、将上一步骤中的样本管（IP组的管子，不包含Input管）置于磁力架中进行磁性分离，吸弃上清。

4.4、在每一管中加入0.5mL的ChIP Wash Buffer 1，重悬磁珠复合物，置旋转混匀仪上孵育5分钟，磁性分离，吸弃上清。仅洗涤一次。

4.5、在每一管中加入0.5mL的ChIP Wash Buffer 2，重悬磁珠复合物，置旋转混匀仪上孵育5分钟，磁性分离，吸弃上清。仅洗涤一次。

4.6、在每一管中加入0.5mL的ChIP Wash Buffer 3，重悬磁珠复合物，置旋转混匀仪上孵育5分钟，磁性分离，吸弃上清。仅洗涤一次。

4.7、在每一管中加入0.5mL的ChIP Wash Buffer 4，重悬磁珠复合物，置旋转混匀仪上孵育5分钟，磁性分离，吸弃上清。仅洗涤一次。

温馨提示：

如果在后续实验中观察到高背景(过多的非特异性结合)，可以额外增加洗涤步骤的时间和次数。也可以在实施步骤Step 4.2 之前，不加一抗，直接用Protein A/G 磁珠孵育染色质片段样本 1 小时，磁力分离，丢弃此磁珠，只保留上清，从而预先吸附、清除非特异性结合在磁珠上的染色质片段。将上清液（经过超声或酶片段化处理的染色质）转移至一个新管中，然后按照前述步骤Step 4.2 对一抗和磁珠进行先后孵育。这种降低非特异性结合的方法叫做PRE-CLEAR。

可以在最后一次的洗涤步骤中，添加一个Western Blotting实验，评估和验证目的蛋白有无被成功捕获，具体方法如下：在最后一次洗涤时，取出40μL的磁珠复合物悬液，加入10μL的WB loading buffer上样缓冲液，煮沸10分钟，磁力分离或离心分离，吸出上清，丢弃磁珠，将此上清拿去做WB实验中的SDS-PAGE电泳跑胶，随后进行WB实验的正常转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、曝光显影的流程，只是需要注意，虽然WB实验检测的是同一个靶蛋白，但ChIP的一抗不一定适用于WB实验。因为ChIP一抗更倾向于结合天然构象的靶蛋白，而WB实验中的靶蛋白已经被煮沸变性，WB一抗必须是识别靶蛋白线性表位，而不是天然构象。这里这个WB验证环节的目的是评估刚才的免疫沉淀IP实验是否成功把靶蛋白捕获沉淀下来。

洗脱并解交联蛋白质-DNA复合物

开始之前

• 在此环节，所有样本管都要进行洗脱处理，包括所有IP管。

• 如果是交联过的样本，则需要解交联处理，包括所有Input管和IP管

• 将蛋白酶K从-20度中取出，置于室温融化备用，同时将ChIP Elution Buffer从4度中取出恢复至室温，以便确保里面的SDS絮状物溶解消失。

• 配制最终的即用型ChIP Elution Buffer：每个样本管的用量为100μL 的ChIP Elution Buffer中加入1μL蛋白酶K，混合均匀备用。按照实验中全部样本管的总数量乘以上述的单个用量，计算整体用量，合并配制。

4.8、将洗涤完成的每个IP管和Input管中加入100μL 新鲜配制的即用型ChIP Elution Buffer（已经加了蛋白酶K）。

4.9、置于eppendorf的thermomixer®恒温振荡金属浴（或等效仪器）上，62℃孵育2个小时，轻微振荡。

4.10、随后95℃再次孵育10分钟。结束后冷却所有样本管至室温。

4.11、将所有样本管放入磁力架中进行磁性分离，小心吸出上清，并转移到新的1.5mL离心管里。

温馨提示：

此时得到的上清就是本次染色质免疫沉淀实验洗脱得到的DNA片段，每管洗脱物约为100μL。

Step 5：回收DNA——genomic目的DNA片段纯化

由于Step 4中洗脱得到的上清中除了DNA片段以外，还含有蛋白酶K，多种因酶切而生成的多肽、寡肽、氨基酸等等“杂质”，因此需要进行一次DNA片段的纯化。

5.1、在装有免疫沉淀洗脱物的所有样本管内每管加入600 μL苯酚：氯仿：异戊醇混合液（混合比例为25:24:1），颠倒混匀10~15次后，室温13000 g离心10分钟，转移上层水相到新离心管中。

5.2、每管加入25 μL的kit中ChIP专用盐溶液、1 μL的kit中DNA沉淀增强物及1.2 mL无水乙醇，-20℃沉淀样品30分钟2小时。

5.3、4℃，16000 g离心30分钟，弃上清。

5.4、加入500 μL的80%乙醇（现用现配）洗涤沉淀，4℃，16000 g离心30分钟，弃上清，室温3-5分钟自然干燥乙醇。

注意：采用轻柔颠倒洗涤沉淀一次，吸头不可以触碰DNA沉淀，也不可过于干燥，过于干燥会导致后续沉淀再次溶解十分困难。

5.5、加入50 μL无核酸酶H2O，溶解沉淀的DNA。所得液体即为高纯度的DNA片段。

5.6、富集后的DNA检测，NanoDrop检测Input组、IP组及IgG组产物DNA的浓度。同时也可以取5 μL样本使用2%琼脂糖凝胶120V恒压电泳15分钟，检测DNA片段大小的分布状态。

-20度，小心保存每管50 μL的DNA片段混合物

用于下游三大实验（标准PCR、荧光定量PCR、ChIP-sequence）

技术参考文献

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