如何精准把握细胞消化时间？

在贴壁细胞培养中，细胞消化是至关重要的步骤，可以说直接影响后续实验的成败。消化时间过长过短都会导致细胞受到损伤，进而出现细胞生长速度减慢，大量漂浮不贴壁，拉丝、空泡等异常形态，甚至细胞死亡的情况。因此把握最佳消化时间是培养细胞的必修课之一。

一、了解细胞贴壁强弱

首先，了解细胞的贴壁的强弱是判断最佳消化时间的基础。不同种类的细胞在贴壁强度是有差异的，如果你对你将要培养的细胞并不了解，可以先去ATCC、上海中科院细胞库等权威细胞库查看消化时间，作为我们的预期消化时间。

二、消化试剂的配方、品牌将影响消化时间

以最常用的胰蛋白酶为例，胰酶浓度越高消化能力越强，添加EDTA也可促进胰酶的消化作用。另外，即使是相同配方的胰酶，因不同厂家生产工艺不同，消化效果也会有差异。因此实际消化时间可能与ATCC等细胞库描述不一样，应该以具体情况确定。

三、细胞部分脱落时即可终止消化

如果你是第一次消化细胞、购买了新的细胞、或者换了消化试剂的品牌，需要摸索一次最佳消化时间，作为以后消化该细胞的标准。以下是确认最佳消化时间的方法，以胰酶为例：

1.加足量PBS润洗细胞1-2次，清除残留的培养基，润洗的PBS也尽量吸干净（培养基中的血清会抑制胰酶活性、残余过多PBS会稀释胰酶，均会影响消化效果）；

2.将适量胰酶加入培养器皿，摇晃铺匀后放入37℃培养箱进行消化。随后每隔30秒拿出观察一次，若细胞未发生脱落，则放回培养箱继续消化。（贴壁紧的细胞可以延长时间，1-5min观察一次，或参考权威细胞库提供的参考时间）；

3.直到显微镜下可见细胞间隙变大并脱落，将培养器皿对着灯光观察，肉眼可见部分细胞开始滑落，说明消化完成，可以加入完全培养基进行中和（注意贴壁较紧的细胞建议先吸取正在消化的胰酶轻轻吹下细胞，再加终止液）。

四、值得注意的细节

细胞变圆但未脱落时建议继续消化，此时吹打细胞可能会导致细胞膜破裂，所以建议细胞能滑落再终止消化，确保细胞是被胰酶消化下来而不是被强行吹下的。

强行吹下细胞的损伤比胰酶对细胞的损伤大得多，大部分细胞系对胰酶有一定耐受性，遇到消化不下来的情况可以适当延长时间。

PBS仅润洗一次可能还有残余培养基，消化时间将变长。润洗两次一定程度上缩短消化时间。

贴壁紧的细胞不宜放置在室温消化。