项目文章 | 拟南芥中RLI2通过促进翻译机制的组装过程来调控雌配子体和胚胎的发育。

2023年7月，上海交通大学林文慧教授为通讯作者，于世霞博士为第一作者，在生物学1区Top期刊Cell Reports(IF=8.8)上发表了题为“RLI2 regulates Arabidopsis female gametophyte and embryo development by facilitating the assembly of the translational machinery”的文章，文章阐明了在拟南芥中RLI2的沉默会影响参与翻译调控和胚胎发育的蛋白亚群的翻译效率，进而影响雌配子体和胚胎的发育，研究结果表明RIL2促进翻译后的组装，间接调控了生长素信号以调节植物的生长发育。

 研究背景 Origingene 

真核生物的翻译是一个复杂的过程（起始、延伸、终止和核糖体再循环），需要不同调控蛋白的参与，翻译机制的缺陷通常会导致胚胎致死率升高或者严重的生长缺陷，RLI2与多种翻译相关因子相互作用，调控细胞的翻译过程。本研究中RIL2/ABCE2蛋白会显著影响拟南芥的翻译效率进而影响胚胎的发育。实际操作中发现拟南芥中RLI2的沉默会影响参与翻译调控和胚胎发育的蛋白亚群的翻译效率，进而影响雌配子体和胚胎的发育。研究结果表明RIL2促进翻译后的组装，间接调控了生长素信号以调节植物的生长发育。

ABC蛋白存在于所有生物体中，在配子和胚胎发育中发挥重要作用；ABCE蛋白最初被鉴定为RLI蛋白（RNase L抑制蛋白）；RLI/ABCE在发育中的作用已在不同物种中被广泛研究，但在拟南芥中尚未发现RLI突变体，对于RLI在配体体发育、胚胎器官发生和分生组织形成中的作用尚不清楚。RLI2编码了一个拟南芥ABCE蛋白，其在植物发育中的功能尚未被研究。前人研究表明，参与核糖体生物发生和翻译过程的基因在拟南芥的配子体和胚胎发育中起到了关键作用。

在本研究中，研究证明了拟南芥中RLI2是翻译机制中的一个保守因子，对生长和发育至关重要，RLI2功能的丧失会导致配子体和胚胎发育的停滞，进而导致生育能力的降低；通过RNAi沉默RLI2的拟南芥突变体表现出显著翻译缺陷和发育缺陷；研究借助RNA-seq和4D蛋白组，鉴定了与生长素相关基因的模块基因；研究揭示了RLI2和翻译机制间的重要联系，对拟南芥的发育研究至关重要。

研究思路 Origingene 

 研究结果 Origingene 

1.RLI2功能的丧失会导致其生育能力的降低，RLI2是胚胎和雌配子体发育的必需基因。

构建RLI2缺失突变体rli2-1，由于rli2-1纯合子突变体（rli2-1/）不能从rli2-1杂合子植株（rli2-1/+）中分离出来，但rli2-1/+的育性会有显著鉴定，因此本研究对rli2-1/+进行了进一步的分析。野生型的种子发育良好，但rli2-1/+的角果（有14%白色的种子起皱以及9%角果变小及胚珠皱缩），rli2-1/+的纯合体种子胚胎死亡，即无法获得rli2-1/的纯合体植株。并且通过对不同杂交后台的分析，发现rli2-1的雌雄配子体活性均严重降低，而且rli2-1/+胚囊发育异常包含不规则分布的核。研究又引入外源RLI2（利用RLI2天然启动子驱动与mCherry编码序列融合的RLI2基因组序列，并将该结构体（pRLI2：：RLI2-mCherry）引入rli2-1/+中），外源RLI2的引入缓解了rli2-1/+降低的生育能力和胚胎致死表型。综上研究证明了RLI2对拟南芥雌雄配子体和胚胎的发育至关重要。

rli2-1/+胚胎部分表现出异常的细胞分裂，即细胞分裂模式受损，导致严重的形态缺陷和在球状阶段停滞，在早期胚胎模式形成和细胞分裂均有显著影响，通过共聚焦显微镜观察rli2-1/+胚珠不同发育阶段的光学切片，切片显示rli2-1/+胚囊在后期的核迁移和液泡形成均受到影响，导致近13%的rli2-1/+胚囊在3-VI阶段塌陷，其他胚囊相对于野生型也有发育明显延迟的表现（野生型发育成7细胞成熟结构时，rli2-1/+胚囊只有1-4个核），进一步说明了RLI2在雌配子体发育中起到关键作用。同时在对rli2-1/+授粉后进行GUS染色和扫描电镜观察，发现约有33%的胚珠无法诱导花粉产生花粉管，即RLI2的缺失导致胚珠无法吸引花粉管，进而导致部分胚珠无法受精形成胚胎。

2.RLI2功能丧失会损害花粉管的萌发，RLI2定位显示同时存在于细胞核和细胞质中

研究采用Alexender染色检测细胞质活力，DAPI染色检测核结构，扫描电镜观察花粉形态，观察结果显示rli2-1/+的花粉发育与野生型相当，但是rli2-1/+的花粉萌发率显著低于野生型，将花粉管标记物pLat52：：GUS四联体1（qrt1）43、44导入rli2-1/+对花粉管进行标记，结果表明RLI2功能的丧失导致了体内花粉管生长的缺陷，只有诱导部分花粉产生花粉管进入胚珠。

研究对拟南芥不同部位进行实时荧光定量检测RLI2表达量，RLI2在生殖组织中广泛表达；pRLI2：：GUS的转基因植株；pRLI2：：H2B-GFP的转基因植物；检测了RLI2在生殖生长过程中的表达情况，在胚珠、胚珠和花粉中均有高水平的表达；将pRLI2：：RLI2-GFP载体导入rli2-1/+植株中，在细胞质和细胞核中均检测到GFP信号，与核质分离实验的结果一致，综上，RLI2同时定位于细胞质和细胞核中。

3.沉默RLI2会导致拟南芥发育过程中多种缺陷

对rli2-1/+植株进行pUBQ10：：RNAi-RLI2处理，构建出的转基因植株在各种组织中都表现出缺陷，如叶片较小、矮化和结实率。这些植株的未受精率显著提高，且呈现出异常的胚囊，pES1：：H2B-GFP RNAi-RLI2植株的胚珠仅显示出一个细胞核或一个降解的胚囊，结果表明：RNAi-RLI2植株的结实率减少是由于胚囊不受精导致的。定量结果显示，RNAi-RLI2中RLI2的转录水平低于野生型植株，综上结果表明，RLI2的敲除导致了拟南芥的多效性发育缺陷。

4.RLI基因的系统发育分析

研究利用公开数据库，将AtRLI2的氨基酸序列与其他物种的RLI/ABCE序列，包括真核生物和原核生物进行了比较；系统发育分析表明，AtRLI2与甘蓝型油菜（基因库：XP_013678613）的同源性为97.7%，与双子叶和单子叶植物的同源性为96%-92%；在某些物种中，RLI/ABCE家族由两个成员组成，这表明在进化过程中发生了RLI/ABCE基因的复制，为了确定动物和真菌中的RLIs是否也在植物中发挥作用，实验将MmRLI1（GenBank：NP_056566）和ScRLI1（YDR091C）引入到拟南芥RLI2启动子驱动的rli2-1/+植物中。结果表明，pRLI2：：MmRLI1和pRLI2：：ScRLI1的种子植株与rli2-1/+突变体没有显著差异；我们将AtRLI1和AtRLI2分别导入到ScRLI1缺失的酵母中，研究拟南芥RLI基因是否可以取代ScRLI1基因的功能（图S5E和S5F）。结果显示，外源性的AtRLI1和AtRLI2不能挽救致死表型，而ScRLI1可以挽救致死表型（图S5F），说明AtRLIs不能取代ScRLI1的功能。拟南芥rli1基因和ScRLI1基因不能相互替代。

5.敲除RLI2影响翻译机制的组装及翻译效率

RLI/ABCE蛋白亚家族在ABC蛋白的进化分析中最保守，RLI参与了多种翻译过程；研究进行了双分子荧光互补实验，选择拟南芥eIF3的4个亚基进行研究；通过免疫从沉淀（co-IP）验证eIF蛋白与细胞质中RLI2存在相互作用，历史研究显示RLI2也与核糖体形成和生物发生因子相关，表明RLI2参与了多个翻译过程。使用WB分析RLI2蛋白，结果显示RLI2蛋白会出现在40S、60S和80S的核糖体组分中，而不出现在多聚体组分中，表明RLI2与核糖体相关，且对RNAi-RLI2植物进行了多聚体分析，发现与野生型相比，40S、60S和80S核糖体亚基的丰度明显减少。综上RLI2通过与翻译相关因子相互作用，参与了翻译机制的组装。

研究使用l-叠氮同型丙氨酸（Click-iT AHA）标记检测了野生型和RNAi-RLI2植株中新生蛋白的相对水平，该标记与Cy5反应，RNAi-RLI2植株中Cy5荧光的相对水平显著降低即新产生的蛋白丰度限制降低。对野生型和RNAi-RLI2植株进行4D蛋白组和转录组检测分析，进行kegg和go数据库注释和富集分析，富集到了与植物生长的相关通路（核糖体结构成分、糖酵解过程、核小体组装等）。并基于蛋白组数据使用免疫荧光异丙酯脱氢酶1（IPMDH1）和胚胎缺陷3147（EMB3147）蛋白的水平，上述蛋白在RNAi-RLI2中的水平显著降低。综上表明，RLI2基因敲除会导致翻译效率降低。

6.敲除RLI2会干扰生长素的稳态

RNA-seq分析了RNAi-RLI2植株的转录本表达变化，kegg通路分析显示，在RNAi-RLI2幼苗中植物继续信号转导、MAPK信号通路、昼夜节律等重要信号显著富集，上述结果表明，RLI2在多个过程中发挥作用。GO富集结果显示，生长素生物合成过程（GO：0009851）、生长素转运（GO：0060918）和对生长素的反应（GO：000 9733），在下调基因中显著富集；综上数据表明RLI2会影响生长素信号通路。生长素在胚胎发育中起着重要的作用，是唯一一种从受精到种子成熟期间保持高水平的植物激素。检测了生长素反应报告基因DR5：：V2-GFP在野生型中的表达，结果表明，RLI2在早期胚胎发生的顶端-基底模式形成过程中调控生长素的分布。

进一步通过蛋白组数据证实RNAi-RLI2植物中生长素信号通路受损；MP/ARF5蛋白水平降低，ARF5是胚胎和幼苗发育的关键调控因子；将pMP：：MP-GFP引入RNAi-RLI2植物中。与野生型相比，RNAi-RLI2中的MP-GFP信号和蛋白水平显著降低；综上结果表示，RLI2通过调节MP的翻译效率来影响生长素的稳态。

生长素转运蛋白PIN7调控胚胎和幼苗的发育，与野生型相比，RNAi-RLI2中的PIN7-GFP信号和蛋白水平显著降低。RLI2也会调控PIN7的翻译效率，从而影响生长素的极性转运，且植物激素相关的基因在上调基因中显著富集，综上结果表明，RLI2的敲除干扰了拟南芥的植物激素稳态。

参与生长素信号通路的基因在RLI2敲除和hot3-2突变体中均有差异表达：分析了RNAi-RLI2和eIF5B突变体hot3-2中差异表达的基因存在重叠，KEGG分析富集到植物激素与代谢相关的通路，在RNAi-RLI2和hot3-2中的诱导表明，RLI2和eIF在植物激素稳态中具有相似的功能。这些结果表明，RLI2与eIFs相互作用，调节下游植物激素信号，特别是生长素信号，正向调控植物生长。

 结果讨论 Origingene

RLI2与eIFs、核糖体形成和生物发生因子以及翻译释放因子相互作用，参与翻译机制的组装，以调节植物的生长发育；敲除RLI2明显降低了40S、60S和80S核糖体单体和多聚体的丰度，通过蛋白质组分析确定，RLI2的敲除导致蛋白质翻译效率的改变，特别是核糖体蛋白。RLI2的敲除导致营养生长缺陷，即RLI2会在植物生长发育的其他过程中影响花粉和植物的功能。

拟南芥中的RLI家族（RLI1、RLI2）主要在生殖组织中表达，定量结果显示RLI1的转录水平显著低于RLI2，说明RLI2可能在植物的生殖发育中没有发挥主导作用。ABCE/RLI被研究最广泛的功能是它参与翻译过程。在果蝇和酵母中存在功能类似的同源基因（Pixie、ScRLI1）,敲除ABCE1会显著改变酵母、果蝇和哺乳动物中多聚体的丰度；本研究中敲除RLI2也会导致核糖体单体的丰度降低。RLI2与eIFs、核糖体形成、生物发生因子（RPL23aB和RPS2B）和释放因子（ERF1-1、ERF1-2、ERF1-3和EF1a）相互作用，在多个翻译过程中发挥作用，从而影响拟南芥的翻译效率。

ABCE蛋白在植物和人类中也会作为RNA沉默的内源性抑制因子，ABCE1与RNase L特异性形成异二聚体，抑制其与2-5A的结合。组学分析结果显示，野生型与RNAi-RLI2中与胚胎和花粉萌发相关的蛋白的富集程度有很大的区别，表明RLI2影响这些蛋白的翻译效率，调控胚胎发育和花粉萌发。RNAi-RLI2植株的生长素信号相关基因的表达显著下调，对翻译受损突变株系进行生长素信号检测，结果显示生长素信号的抑制是翻译机制受损突变体的共同特征。

结合蛋白组和转录组数据，筛选出其他与拟南芥生长发育的基因（AKRP、AACT2、AtNAP7、ABCB19），上述蛋白丰度的降低可能导致了RLI2突变体中相应的发育缺陷。

敲除RLI2导致全球40S、60S和80S核糖体亚基丰度下降，导致核糖体不足，从而影响核糖体组装，这可能是翻译效率降低的原因。综上，我们的研究结果强调了核糖体组装和翻译调控在配子体发育和胚胎发生中的重要性。

参考文献

Yu, Shi-Xia et al. “RLI2 regulates Arabidopsis female gametophyte and embryo development by facilitating the assembly of the translational machinery.” Cell reports, vol. 42,7 112741. 6 Jul. 2023, doi:10.1016/j.celrep.2023.112741