顶刊精读 | 巨噬细胞介导的髓鞘回收为脑癌恶性提供燃料

[图片上传失败...(image-71f7dd-1727040176308)]

Basic Information

• 英文标题： Macrophage-mediated myelin recycling fuels brain cancer malignancy
• 中文标题：巨噬细胞介导的髓鞘回收为脑癌恶性提供燃料
• 发表日期：19 September 2024
• 文章类型：Article
• 所属期刊：Cell
• 文章作者：Daan J. Kloosterman | Leila Akkari
• 文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867424008249

Highlights

Para_01

• TAMs 回收富含胆固醇的髓鞘，并在胶质母细胞瘤中获得富含脂质的特征
• 由髓鞘碎片清除引起的表观遗传重编程是LLM免疫抑制特征的基础
• LLMs 将髓鞘来源的脂质转移至胶质母细胞瘤细胞，以促进疾病进展
• LLMs与患者侵袭性间质亚型和不良预后相关

Summary

Para_01

1. 在代谢受挑战的环境中生长的肿瘤，如大脑中的胶质母细胞瘤，特别依赖与肿瘤微环境（TME）的相互作用来满足其高能量需求。
2. 为了研究这种代谢相互作用的复杂性，我们使用单细胞和多组学分析来研究胶质母细胞瘤TME的异质性，并识别出具有促肿瘤生成特性的代谢重编程肿瘤相关巨噬细胞（TAM）亚群。
3. 这些TAM亚群，被命名为脂质负荷巨噬细胞（LLMs），以反映其胆固醇积累，经历了表观遗传重编程，表现出免疫抑制特征，并且在侵袭性间充质胶质母细胞瘤亚型中富集。
4. 吞噬富含胆固醇的髓鞘碎片使得TAM的某些亚群获得LLM表型。
5. 随后，LLMs通过LXR/Abca1依赖性方式直接将髓鞘来源的脂质转移到癌细胞，从而为间充质胶质母细胞瘤的高代谢需求提供燃料。
6. 我们的工作深入了解了胶质母细胞瘤进展过程中的免疫代谢相互作用，从而为揭示胶质母细胞瘤中可靶向的代谢脆弱性奠定了基础。

Graphical abstract

[图片上传失败...(image-d0c9c5-1727040176308)]

Keywords

• glioblastoma; macrophages; cholesterol; myelin recycling; lipid metabolism; cancer immunity; tumor microenvironment

Introduction

Para_01

1. 大脑中发生的肿瘤受益于独特的微环境，这一环境随着恶性特征的扩展而被动态利用。
2. 胶质母细胞瘤是最具侵略性的原发性脑肿瘤，它是一种无法治愈的疾病，预后糟糕，并且在肿瘤亚型、微环境生态位和免疫景观方面表现出高度异质性。
3. 除了再现神经发育层次结构外，胶质母细胞瘤亚型还具有影响巨噬细胞极化的不同代谢特征。
4. 由于巨噬细胞在胶质瘤生成和治疗反应中起着重要作用，这些细胞已被探索为有潜力的治疗靶点。
5. 然而，胶质母细胞瘤所表现出的高肿瘤内和患者间异质性挑战了针对脑癌的泛巨噬细胞"一刀切"的治疗方法，这要求深入理解它们的巨大可塑性。

Para_02

1. 确实，巨噬细胞是胶质母细胞瘤肿瘤微环境（TME）中最丰富的免疫细胞，并且在发生学上是多样的，包括驻留在大脑中的小胶质细胞（MG）和浸润的单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）。
2. 尽管最近的单细胞转录组分析报告称，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的亚群可以预测生存或表现出改变的代谢特征，但支撑胶质母细胞瘤TAM多样性和功能的分子基础仍然知之甚少。

Para_03

1. 在这项研究中，我们采用多组学方法来解析TAM亚群的异质性和空间多样性，揭示它们与不同胶质母细胞瘤亚型之间的特定生态位相互作用，以及它们在放疗（RT）后疾病复发中的影响。
2. 通过使用互补的模型系统和功能分析，我们发现TAM介导的机制允许胶质母细胞瘤细胞克服代谢自主型脑环境所特有的挑战。
3. 我们表明，脂质在呈现脂质负荷表型的间充质样（MES样）胶质母细胞瘤癌细胞和TAM亚群之间的代谢相互作用中扮演着中心角色。
4. 随着TAM不断发展，获得这种重新连接的代谢教育，它们获得了增强的促肿瘤发生和免疫抑制特性，从而加剧了胶质母细胞瘤的恶性。
5. 我们的研究深入揭示了TME中TAM亚群特化的机制，并确定TAM代谢重编程是胶质母细胞瘤中可以利用的治疗脆弱性。

Results

Murine glioblastoma displays dynamic cellular subtype heterogeneity in response to RT

小鼠胶质母细胞瘤对放疗表现出动态的细胞亚型异质性反应

Para_01

1. 为了揭示巨噬细胞与肿瘤细胞之间的相互作用的恶性胶质瘤，我们研究了两个基因工程小鼠模型（GEMMs）的单细胞和空间转录组水平上的胶质母细胞瘤TME的动态结构，这两个模型再现了人类胶质瘤发生和治疗反应的关键特征。
2. 这两种GEMMs涉及在内皮素阳性祖细胞中强制表达血小板衍生生长因子-β，背景为Ink4a/ArfKO（PDG-Ink4a）或与肿瘤细胞中短发夹介导的p53敲低相结合（PDG-p53）。
3. 正交地，公开可用的胶质母细胞瘤患者数据集使我们能够验证我们小鼠模型的临床相关性。
4. 我们探讨了与局部微环境相关的巨噬细胞亚群异质性，采用多组学方法和一系列功能性的ex vivo和in vitro实验，以揭示在胶质母细胞瘤TME中巨噬细胞和肿瘤细胞共进化下的促肿瘤相互作用（图1A）。

[图片上传失败...(image-6a0ac3-1727040176308)]

• 图 1. 单细胞分析揭示了胶质母细胞瘤间充质亚型和GPNMBhigh TAMs的同时存在（A）实验设计的示意图，用于评估巨噬细胞亚群和胶质母细胞瘤亚型/生态位异质性和使用胶质母细胞瘤GEMM和公共数据集的相互作用（见STAR方法）。（B）来自scRNA-seq胶质母细胞瘤小鼠数据集的主要细胞群体的均匀流形近似和投影（UMAP）表示（DCs，树突状细胞；ECs，内皮细胞）。（C）scRNA-seq进行的胶质母细胞瘤亚型异质性的视觉表示。（D）每个模型中胶质母细胞瘤细胞亚型的平均分数（外圈）。胶质母细胞瘤细胞（内圈）的伪定位2分配显示为细胞亚型的百分比。
• （E）MG和MDM亚群的UMAP表示。（F）在（E）中确定的MG和MDM群中描绘的通路的基因集富集分析（GSEA）得分。（G）（E）中确定的簇的TAM亚群的伪定位生态位分配；表示为平均值±SEM。（H）左中和中间：在胶质母细胞瘤模型中复发时TAM亚群的不同丰度。右：TAM亚群与胶质母细胞瘤细胞亚型丰度之间的相关性矩阵。
• （I）GPNMBhigh和GPNMBlow TAM簇之间差异表达的前25个基因（表S1C）。（J）在小鼠和人类胶质母细胞瘤scRNA-seq数据集中，GPNMBhigh TAMs与MES胶质母细胞瘤细胞之间的相关性。
• 统计：Kendall趋势检验（H）或简单线性回归（J）（*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001）。P2RY12，嘌呤能受体P2Y12；TNF，肿瘤坏死因子；GPNMB，糖蛋白Nmb；CCR2，C-C趋化因子受体2型；H2-EB1，组织相容性2，II类抗原E Beta。另见图S1和表S1。与图1和2、表S2相关的单细胞RNA测序和VISIUM10x数据集的计算机分析相关基因签名。与图1、表S3相关的巨噬细胞亚群基因集过表达分析。GPNMB的基因集过表达分析。

Para_01

1. 单细胞RNA测序(scRNA-seq)显示，来自原始(未经治疗)和复发性(在5×2 Gy分割放疗后复发)肿瘤的CD45+和CD45−荧光激活细胞分选(FACS)纯化细胞，在两种胶质母细胞瘤GEMM模型中均突显了胶质母细胞瘤TME的细胞异质性(图1B)。为了了解胶质母细胞瘤肿瘤细胞异质性对巨噬细胞教育的影响，我们首先根据之前在单细胞水平上报道的特定转录特征，将肿瘤细胞分为与不同分子亚型相关的分子亚型。
2. 在患者中，这些细胞亚型——类神经祖细胞样(NPC-like)、类少突胶质细胞祖细胞样(OPC-like)、类星形胶质细胞样(AC-like)和MES样——在每个个体肿瘤中均有表达，这种异质性在小鼠胶质母细胞瘤模型中得到了再现(图1C)。
3. 我们使用了Ivy胶质母细胞瘤图谱项目(GAP)数据集，该数据集定义了胶质母细胞瘤主要解剖特征的niche-specific转录特征(LE，前沿；CT，细胞肿瘤；MVP，微血管增殖；PAN，伪栅栏细胞围绕坏死)，将单个肿瘤细胞分配到一个伪空间位置，并发现胶质母细胞瘤细胞亚型在这些niche中异质分布(图1D)。

Para_02

1. 接下来，我们分析了原发性和复发性小鼠胶质母细胞瘤中癌细胞肿瘤内异质性，并探讨在放疗后的复发疾病中，是否如人类肿瘤中所见，发生了亚型转变。
2. PDG-p53模型表现出主要的AC样原发肿瘤，而在复发时转变为OPC样主导组成，尽管存在高肿瘤间变异性（图1D）。
3. 与之不同的是，以OPC样肿瘤细胞为主导群体的PDG-Ink4a胶质母细胞瘤在复发时预测性地向更富含MES表型的方向转变（图1D）。
4. 总的来说，这些结果显示异质性和动态的癌细胞亚型变化在小鼠PDG驱动的肿瘤中以阶段和生态位依赖的方式发生，与胶质母细胞瘤患者的报道结果相呼应。

Macrophage subset dynamics correlate with glioblastoma stage, cellular subtype composition, and local niches

巨噬细胞亚群动态与胶质母细胞瘤阶段、细胞亚型组成和局部生态位相关

Para_01

1. 我们接下来探索了癌症细胞亚型动态与巨噬细胞异质性的异型相互作用。
2. 无监督聚类分析将MDM和MG细胞分成了8种状态，包括4种MG和4种MDM亚群（图1E和S1A）。
3. 我们检查了这些不同TAM身份的转录表型与胶质母细胞瘤微解剖生态位、疾病阶段和分子亚型的关系。
4. 在两种TAM亚群中，我们观察到了从预先激活（MG1-P2RY12和MDM1-CCR2）到炎症（MG2-TNF和MDM2-H2-EB1）、代谢活跃（MG3-GPNMB和MDM3-GPNMB）以及增殖状态（MG4-MKI67和MDM4-MKI67）的表型谱（图1F和S1B-S1D；表S1A、S1B和S2A-S2H）。
5. 与之前报道的复发性胶质母细胞瘤TME中MDM含量增加一致，复发性肿瘤中MDM4-MKI67的丰度显著增加，且MG4-MKI67和MDM4-MKI67群都与MES样胶质母细胞瘤细胞的存在呈正相关（图1H）。
6. 时间戳转录特征揭示了从MDM1到MDM3的48小时时间戳逐渐富集，这表明了MDM中发生了一种分化轨迹，而不是TME中亚群的扩张（图S1E）。

[图片上传失败...(image-564004-1727040176308)]

• 图S1：对胶质母细胞瘤中巨噬细胞景观的深入转录组分析，与图1相关（A）堆积小提琴图描绘了在图1B和1E中展示的MG和MDM群体（52,688个细胞）中定义MG1-4和MDM1-4簇的代表基因的表达；表S1A。所有PDG-Ink4a原发（n=3）和复发（n=3）以及PDG-p53原发（n=4）和复发（n=3）肿瘤样本中的MG和MDM均有代表。
• 颜色与图1E中呈现的细胞簇相对应。（B）热图显示从GSEA获得的与每个巨噬细胞簇相关的已发表特征的平均富集分数，数据按列在1和0之间缩放。显示的特征来自表S1B中引用的已发表研究。
• （C和D）条形图描绘了每个MG（C）和MDM（D）簇特有的相关通路的调整后p值。结果是通过 对每个簇的前30个显著差异表达基因（padjusted<0.05）进行基因集富集分析产生的（见表S2）。
• （E）线图描绘了每个MDM簇中12小时和48小时胶质母细胞瘤MDM时间戳模块的平均富集分数。（F）饼图表示每个MG亚群占健康脑中总巨噬细胞百分比，通过scRNA-seq捕获。
• （G）条形图显示了与GPNMBlow或GPNMBhigh簇中增加的前30个差异表达基因相关的显著富集通路的调整后p值（表S3）。统计方法：Fisher精确检验与Benjamini-Hochberg方法结合，用于多假设检验的校正。
• （H）小提琴图显示了每个MG和MDM簇的GPNMBhigh特征富集分数，显示了每个簇中分配为GPNMBhigh的巨噬细胞百分比。（I）饼图表示通过scRNA-seq对所有测序肿瘤中定义为GPNMBhigh TAMs的巨噬细胞亚群组成。
• （J）散点图描绘了T细胞含量（作为CD45+细胞的百分比）与胶质母细胞瘤患者样本scRNA-seq数据集中的GPNMBhigh TAMs丰富度（作为总TAMs的百分比）之间的相关性。每个数据点代表一个单独的胶质母细胞瘤肿瘤（n=22）。红线表示简单线性回归。Pearson相关系数和p值显示在右上角。

Para_01

1. 正如预期的那样，预激活的MG1-P2RY12簇，与从健康大脑中FACS纯化的MG非常相似，预计在肿瘤LE中与其他MG亚群相比会过度表达，表明肿瘤从MG起源的大脑实质中侵入（图1G和S1F）。
2. 同样，类似预激活的单核细胞渗透到肿瘤部位的MDM1-CCR2簇（图S1A和S1E），预计会在MVP区域富集，这与外周招募的预期一致（图1G）。

Para_02

1. 从这些特定于发生的簇中，我们鉴定出具有炎症特征的巨噬细胞。
2. 在微胶质（MG）室中，组成MG2-TNF簇的细胞同样具有在神经炎症中报道的转录教育，因此高表达促炎基因（Tnf、Ccl4和Ccl3）和神经炎症反应途径（图1F、S1B和S1C；表S1B）。
3. 相对应的MDM2-H2-EB1簇也表现出了炎症反应基因表达的增加，尽管性质不同，并且通过增加抗原处理特征（H2-Eb1、H2-Aa和Cd74）区分开来（图S1B和S1D；表S1A）。
4. 有趣的是，MG2-TNF和MDM2-H2-EB1巨噬细胞簇与MES2细胞亚型呈负相关（图1H），表明富含MES的胶质母细胞瘤总体上表现出较低的炎症性TAMs，这与患者中它们的侵略性表型一致。

Para_03

1. MDM3-GPNMB 簇位于 MG 和 MDM 聚集以及 MDM 分化轨迹的顶端（图 1E 和 S1E），在 MES 富集的 PDG-Ink4a 复发肿瘤中特异性增加（图 1H）。
2. 与 MG3-GPNMB 细胞一起，这两个簇主要被预测位于 PAN（低氧）胶质母细胞瘤生态位中，MES2 肿瘤细胞偏好居住在这里（图 1D 和 1G）。
3. 功能上，来自 MDM3-GPNMB 和 MG3-GPNMB 簇的巨噬细胞具有与"脂质相关"巨噬细胞相似的转录教育（图 S1B；表 S2C 和 S2G）。
4. 有趣的是，这些巨噬细胞在转录上与之前在胶质母细胞瘤小鼠模型和患者样本中具有脂质/吞噬教育或具有促肿瘤生成的免疫抑制功能的 TAM 相似。
5. 相比之下，这些簇表现出所有 TAM 亚群中最低的炎症表型，同时呈现细胞通路活化增加，这些通路涉及泡沫细胞分化（图 1F）。
6. 因此，这些无偏分析突显了 MDM3-GPNMB 和 MG3-GPNMB TAM 亚群可能的脂质相关或脂质负荷表型。
7. 虽然脂质负荷巨噬细胞（LLMs）之前在肥胖或动脉粥样硬化的背景下观察到，最近在一小部分癌症中作为一种促肿瘤生成的 TAM 亚群出现，但它们在大脑中的存在仅在有衰老和神经退行性疾病的过程中有报道。
8. 总的来说，我们的发现表明，与 LLMs 转录相似的 GPNMBhigh TAMs 在 MES 富集的胶质母细胞瘤中增加，随着 PDG-Ink4a 胶质母细胞瘤在复发性疾病中转向这种亚型，并与低氧微解剖生态位中的 MES 样癌细胞相关。
9. 假设这种异型交叉对话可能会推动胶质母细胞瘤的进展和 OPC 向 MES 的转变，我们试图进一步验证 LLMs 在胶质母细胞瘤中的存在及其意义。

Para_04

1. 利用区分MG3-GPNMB和MDM3-GPNMB TAM群落的差异表达基因，我们生成了一个GPNMBhigh特征，以可靠地量化呈现与其它疾病中的LLMs相似的转录表型的TAMs的百分比（图1I和S1G；表S3A和S3B）。
2. 有趣的是，除了MG3/MDM3群集之外，被归类为GPNMBhigh的TAMs还包括属于其他TAM子集的细胞（图S1H和S1I）。
3. 与之前的研究一致，相关分析揭示了MES样胶质母细胞瘤细胞与GPNMBhigh巨噬细胞在小鼠和人类胶质母细胞瘤中的强烈相关性，不受原发/复发性疾病阶段的影响（图1J）。
4. 正如预期，从它们的抗炎特性（图1F）来看，GPNMBhigh巨噬细胞与患者样本中的淋巴浸润呈负相关，支持脂质负荷表型的巨噬细胞在MES富集的胶质母细胞瘤的免疫抑制性中起作用的观点（图S1J）。
5. 总的来说，我们的结果表明GPNMBhigh TAMs通过获得脂质负荷、抗炎表型并与侵袭性MES样亚型相关联，具有功能上的重要性。

Spatial co-localization of GPNMBhigh macrophages with MES-like cells in hypoxic niches

GPNMBhigh 巨噬细胞与 MES-like 细胞在缺氧生态位中的空间共定位

Para_01

1. 为了加深我们对巨噬细胞亚群与胶质母细胞瘤细胞亚型之间空间相互作用的了解，我们对小鼠胶质母细胞瘤组织切片进行了空间转录组学分析。
2. 使用代表巨噬细胞（IBA1）、微血管周细胞（MVP，CD31）、普遍缺氧标记（PAN，缺氧标记物pimonidazole）、低密度细胞（LE，低密度DAPI）和高密度细胞（CT，高密度DAPI）的免疫荧光（IF）染色，以可视化不同微解剖胶质母细胞瘤生态位中的TAM存在（图2A）。
3. 重要的是，这些染色与定义Ivy GAP转录生态位特征的分类相重叠（图2B）。
4. 此外，针对每种胶质母细胞瘤细胞亚型的特定基因列表被用来根据该位置最代表性的亚型对点进行分类（图2B）。
5. 我们使用一个3步分类策略来分配巨噬细胞亚群分布，以关联生态位和胶质母细胞瘤细胞亚型（图S2A）。
6. 这种方法揭示了TAM亚群和胶质母细胞瘤细胞亚型在原发性和复发性肿瘤中的丰富程度和空间共定位，这些肿瘤来自两种胶质母细胞瘤GEMMs（图2C和2D）。

[图片上传失败...(image-9fca33-1727040176307)]

• 图 2. 类似MES的癌细胞和GPNMBhigh TAMs在缺氧生态位中共定位（A）代表性免疫荧光染色，用于VISIUM 10X空间转录组学的冷冻新鲜脑肿瘤切片。（B）根据VISIUM 10X测序点（见STAR方法）对主导生态位和胶质母细胞瘤细胞亚型转录活性的分类可视化。（C）空间共存工作流程：将TAM亚群、胶质母细胞瘤细胞亚型和生态位的转录模块分配给每个点，以推断相关系数。（D）中央：TAM亚群转录模块与胶质母细胞瘤细胞亚型（顶部）或微解剖生态位转录模块（底部）在所有VISIUM 10X样本中的相关性矩阵；点颜色和大小对应于相关系数。TAM亚群、肿瘤生态位或胶质母细胞瘤细胞亚型在复发性与原发性胶质母细胞瘤中的出现LogFC显示在矩阵的底部和右侧；数据表示为平均值+S.D.（E-G）空间转录组学分析的代表可视化，突出显示GPNMBhigh匮乏（1）和丰富（2）区域。将分配为GPNMBlow或GPNMBhigh的点覆盖在相应的IF图像上（E），并与胶质母细胞瘤细胞亚型（F）或微解剖生态位（G）平行，如（B）中所定义。统计：Kendall趋势检验（D）（∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001）。另见图S2和表S2。

[图片上传失败...(image-9b8796-1727040176307)]

• 图S2.巨噬细胞亚群的空间分析及验证脂质负载巨噬细胞在转录水平上代表高级别GBM肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中的GPNMBhigh，与图2和图3相关（A）使用来自PDG-Ink4a原发肿瘤的代表性Visium 10X数据集，确定巨噬细胞亚群空间分布的3步分类策略示意图。
• 在将斑点点确定为泛巨噬细胞特征（Aif1、Lgals3、Itga1、Trem2、P2ry12和Siglech）阳性后，根据微glia特异性基因表达（P2ry12和Siglech）将斑点归类为MG或MDMs。
• 为每个MG或MDM簇使用特定的基因特征（见表S1H），以分配亚群得分。
• 最高的亚群得分将每个相应的点分类到TME中的特定TAM亚群（右图）。
• （B）代表性IF图像，显示新鲜冷冻的PDG-Ink4a小鼠胶质母细胞瘤组织切片中的初级组织切片。
• DAPI：核染料（蓝色）；IBA1：泛巨噬细胞（洋红色）；PLIN2：脂滴（LDs）（白色）；BODIPY：中性脂质标记（黄色）。
• IBA1阳性但PLIN2和BODIPY阴性的细胞被鉴定为非LLMs（左放大）。
• IBA1、PLIN2和BODIPY均阳性的细胞被鉴定为LLMs（右放大）。
• （C）IF定量LLMs（IBA1+细胞，表面面积为≥500像素[0.325μm/像素]且含有≥5个PLIN2+斑点[定义为LDs]）作为PDG-Ink4a荷瘤小鼠原发性及复发性肿瘤中总TAMs的百分比。
• （D）在PDG-Ink4a胶质母细胞瘤的原发性和复发性肿瘤中，低氧和无低氧区域中LLMs的定量。
• 连接的点对代表相同的样本。
• （E）代表性流式细胞术图，展示复发性PDG-Ink4a胶质母细胞瘤中LLM FACS纯化的门控策略。
• 活巨噬细胞（CD45+CD11b+Ly6ClowLy6Glow）的每个TAM亚群（MG；CD49dlow）和MDMs（CD49dhigh）根据SSC-A（粒度）和BODIPY（中性脂质）强度被分类为LLMs或非LLMs（与其起源无关）。
• （F）热图描绘了RNA-seq分析中LLMs和非LLMs之间标准化基因表达的对数倍变化。
• 热图中显示的基因在图3B中所示的脂质负载MG和MDMs中普遍上调。
• 统计方法：两阶段逐步非配对t检验（C）或双尾配对t检验（D）。
• 数据表示为平均值+SEM（C）。

Para_01

1. 空间转录组分析证实，属于预激活MG1-P2RY12群集的MG确实在肿瘤LE中富集（图2D）。
2. 重要的是，尽管所有MDM群集都与MES1亚型相关，但GPNMBhigh TAMs特异性地与MES2胶质母细胞瘤细胞的存在相关，尤其是在PAN生态位中，这两种细胞类型都丰富且它们的相互作用增强（图2D-2G）。
3. 我们识别出在TME中表达脂滴标记物perilipin-2（PLIN2）和中性脂质染色BODIPY的TAMs，确认了特定TAM亚群中脂滴的积累（图S2B）。
4. 与PDG-Ink4a模型中OPC向MES转变后的RT期间GPNMBhigh亚群富集一致（图1D和2D），在复发时观察到显示脂质负荷表型（PLIN2+脂滴水平高和大小增加）的TAMs显著增加（图S2C）。
5. 此外，结合PLIN2染色和pimonidazole确认了LLMs在缺氧区积累，尤其是在MES2胶质母细胞瘤细胞所在的复发环境中（图1D和S2D）。
6. 这些发现突显了GPNMBhigh TAMs与缺氧生态位中的MES样肿瘤细胞之间的复杂互惠通讯，并表明GPNMBhigh巨噬细胞显示出特有的脂质负荷表型。

LLMs display metabolic and immunosuppressive programs associated with altered chromatin landscapes and promote glioblastoma relapse post-RT

LLMs显示出与改变的染色质景观相关的代谢和免疫抑制程序，并促进放疗后的胶质母细胞瘤复发

Para_01

1. 为了探索脂质负荷的GPNMBhigh TAM的形成起源，我们首先验证了GPNMBhigh巨噬细胞与LLMs无法区分，并对来自PDG-Ink4a肿瘤的FACS纯化的脂质富集（BODIPYhigh，SSC-Ahigh）MG和MDMs进行了RNA-seq分析（图3A和S2E）。
2. 通过比较MG和MDM亚群中的LLMs和非LLMs之间的差异表达基因，我们鉴定出在LLMs和非LLMs之间特有和共享的基因签名，这些基因来自不同的起源（图3B；表S3A和S3B）。
3. 在来自组织驻留或单核细胞来源的FACS纯化LLMs中普遍上调的基因与GPNMBhigh TAM转录签名中的几个基因重叠（图1I和S2F）。
4. 实际上，GPNMBhigh巨噬细胞在转录上与LLMs重叠，证实了GPNMBhigh巨噬细胞在胶质母细胞瘤中确实是脂质负荷的（图3C）。
5. 这些发现促使我们将GPNMBhigh TAMs称为LLMs，并使用GPNMBhigh签名来转录识别LLMs。

[图片上传失败...(image-9f1c44-1727040176307)]

• 图 3. 脂肪负载巨噬细胞的促肿瘤生成表型与染色质可及性的丢失相关（A）脂肪负载巨噬细胞（LLM）多组学分析的示意图。（B）FACS 分离的 MG 和 MDM 亚群中非 LLM 和 LLM 的 RNA-seq 识别的差异表达基因的维恩图。（C）堆叠小提琴图描绘了根据 FACS 纯化的巨噬细胞亚群 RNA-seq 分析鉴定的基因特征（表 S1D）在图 1E 中的 TAM 亚群转录富集情况。（D）不同染色质可及性区域巨噬细胞亚群的平均峰型图谱（顶部）和热图（底部），显示归一化的 ATAC-seq（通过测序检测转座酶可及染色质的分析）信号。（E）与非 LLMs 相比，LLM 启动子区域基因表达与更高和更低的可及性相关的 LogFC，基于 MG 和 MDM 亚群中相同基因的表达。（F）基于 MDM-LLMs 相较于非 LLMs 的启动子可及性更高或更低相关的基因表达显著富集基因集的 Log10(FDR, 假发现率)。（G）来自 MDM 亚群的归一化相关 ATAC-seq 峰信号。（H）巨噬细胞亚群中 H3K27me3 的流式细胞术 MFI。（I）巨噬细胞亚群中指定细胞表面标记表达的 MFI 的 Log2FC。统计数据见图 S3J。（J）流式细胞术定量 LLMs（BODIPYhigh, SSC-Ahigh）。（K）Kaplan-Meier 曲线显示对照组（DMSO）；RT（5x2 Gy）和 DMSO；SSO（每天 30 mg/kg 治疗）；或 RT + SSO 治疗组随时间变化的动物生存情况。（L）来自（K）治疗组中 LLMs（BODIPYhigh, SSC-Ahigh）的流式细胞术定量。统计数据：Wilcoxon 符号秩和检验（E），两因素方差分析伴 Sídák 多重比较校正（H 和 L），两阶段逐步上升未配对 t 检验伴 Benjamini、Krieger 和 Yekutiel 多重比较校正（J），或对数秩检验（K）。数据表示为平均值 ± SEM（H–J 和 L）。另见图 S2、S3 和 S4 以及表 S3 和 S4。

Para_01

1. 为了深化我们对驱动大脂质巨噬细胞（LLM）形成的潜在机制的理解，我们检查了通过FACS纯化的含脂质和不含脂质的MG和MDM的染色质状态和可及性（图3A）。
2. 我们确认MG和MDM显示出与它们胚胎起源相关的基因表达所特有的发育特异性峰（分别是Sall135和Itga4,10）（图S3A）。
3. 与MG相比，MDM显示出更多的可及性调控元件，支持这样的观点，即组织印记限制了巨噬细胞向功能特化的可塑性（图S3B）。
4. 在非含脂质MDM中富集的峰被鉴定为调节炎症反应和细胞因子介导的信号通路的基因，而在非含脂质MG特有的峰与调节组织常驻功能的基因表达相关（图S3C和S3D；表S4A-S4H）。

[图片上传失败...(image-67d954-1727040176307)]

• 扩展的特定于个体发生的富含脂质的巨噬细胞染色质景观分析，与图3相关（A）与MG特定（Sall1）或MDM特定（Itga4）的可访问性相关的基因区域在LLMs和非LLMs中的MG和MDM亚群中的标准化ATAC-seq信号。（B）维恩图描绘了非富含脂质的MG和MDM中的ATAC-seq的共识峰数。（C和D）直方图显示了基于（B）中描绘的差异表达基因的非富含脂质的MDM（C）和MG（D）中显著富集基因集的-log10(FDR)。垂直线在-log10(FDR)=2处表示显著性阈值。颜色表示差异可访问基因和基因集之间的重叠。（E）维恩图描绘了基于ATAC-seq分析确定的MG（顶部）和MDM（底部）中的LLMs与非LLMs之间的共识峰。（F）点图描绘了源自单核来源的LLMs（左）和非LLMs（右）中所有差异可访问峰的motif富集分析的-log10(FDR)。颜色代表差异可访问峰与所有检测到的峰（背景）相比的logFC。相关的motif簇用蓝色突出显示，与这些motif相关的TFs在底部面板中给出。（G）热图描绘了基于变量x轴的比较的染色质调节因子基因表达的logFC，这是从批量RNA-seq分析（如图3B所示）确定的。（H）直方图描绘了来自复发性PDG-Ink4a肿瘤携带小鼠的MG（紫色）和MDM（蓝色）亚群中的LLMs和非LLMs的H3K27me3的平均荧光强度（MFI）。（I）来自原发性（左）和复发性（右）PDG-Ink4a肿瘤携带小鼠的MG和MDM亚群中的LLMs和非LLMs的EZH2的平均荧光强度（MFI）的量化。（J）与同一原发性PDG-Ink4a胶质瘤样本中的非富含脂质的MG和MDM相比，富含脂质的MG（左）和MDM（右）中描述的细胞表面标记物的MFI。统计方法：两阶段逐步增加的多重配对t检验，使用Benjamini，Krieger和Yekutieli校正进行多重测试（H-J）。数据以均值+SEM（H-J）表示。

Para_01

1. 我们接下来评估了与脂质负荷表型相关的染色质景观变化。
2. 无论其发生学如何，LLMs 与非LLM对照组相比，失去了对许多染色质区域的访问权限，而获得的峰明显较少，显示出更为微妙的变化（图3D和S3E）。
3. 有趣的是，只有脂质负荷的MDMs中，染色质对启动子区域的可及性与基因表达相关，而在脂质负荷的MG中则不然（图3E）。
4. 脂质负荷MDMs中低染色质可及性与炎症通路相关基因的表达下调相关，例如H2-Eb1和Cd74（图3F和3G）。
5. 重要的是，与无非脂质负荷MDMs相比，脂质负荷MDMs在脂质运输（Abca1）、吞噬作用和突触修剪相关基因中获得了特定峰，同时失去了与胆固醇生物合成（Dhcr24）相关基因区域的可及性（图3F和3G）。
6. 我们接下来对这些峰进行了基序分析，结果显示在无非脂质负荷MDMs中富集了NF-κB（核因子 kappa-轻链增强子活化的B细胞）和RUNX（Runt相关转录因子），这两个转录因子已知可介导炎症级联反应（图S3F）。
7. 相比之下，脂质负荷MDMs显示出富集了已知参与巨噬细胞免疫抑制表型的TFs，如CCAAT/增强子结合蛋白β（C/EBPβ）和激活转录因子3（ATF3）（图S3F）。

Para_02

1. 有趣的是，H3K27me3组蛋白去甲基化酶Kdm6b在脂肪负荷的巨噬细胞（MG）和单核细胞衍生的巨噬细胞（MDMs）中均显著下调（图S3G）。
2. 这些发现表明，Kdm6b介导的H3K27me3抑制性组蛋白标记的丢失是LLM炎症基因染色质可及性降低的基础。
3. 流式细胞术分析证实，与未负荷脂肪的MDMs相比，脂肪负荷MDMs中的H3K27me3水平升高。
4. MG中升高的H3K27me3水平与它们较低的染色质可及性状态相关，这可能阻碍了原发性肿瘤和复发性肿瘤中来自TME的外在信号的整合（图3H和S3H）。
5. 除了下调Kdm6b外，LLMs还显示出EZH2（Enhancer Of Zeste Homolog 2）水平增加，这是H3K27me3的主要催化酶。
6. 与MDMs相比，MG中较高的EZH2水平与其脂肪负荷表型无关，这可能是组织驻留MG中H3K27me3基础水平升高的基础（图S3I）。

Para_03

1. 脂质负荷的MG和MDMs与它们的非LLM对应物相比显示出增强的免疫抑制特征，包括CD39和PD-L1（程序性死亡配体1）水平的增加（图3I和S3J）。
2. 特别是，脂质负荷的MDMs下调了主要组织相容性复合体（MHC-II）的表达，这表明当MDMs获得LLM表型时，抗原呈递功能受损（图3I）。
3. 有趣的是，LLMs中的脂质受体CD36表达上调（图3I），这与我们之前观察到的LLMs特有的脂滴积累特征相一致（图S2B）。
4. 复发PDG-Ink4a型胶质母细胞瘤中脂质负荷MDM的含量增加，与scRNA-seq揭示的OPC向MES的转化相一致（图1D和3J）。
5. 重要的是，在未经治疗的NF1驱动的MES主导的胶质母细胞瘤模型42中，脂质负荷MDM富集与MES样胶质母细胞瘤之间的关联得到了证实（图3J）。
6. 总的来说，我们的发现进一步巩固了MES样胶质母细胞瘤与LLMs之间的关联，其免疫抑制和脂质相关表型部分是由Kdm6b的下调和EZH2的上调驱动的。
7. 因此，脂质负荷MDMs中H3K27me3抑制性标记的升高与炎症基因下调背后的染色质可及性的丧失相关。

Para_04

1. 接下来，我们评估了LLMs在胶质母细胞瘤进展中的功能意义，通过针对CD36，一个主要由含脂质的MDMs和MG优先表达的脂质受体（图3I、S4A和S4B）。
2. 基于PDG-Ink4a模型中LLM频率的动力学（图S4C），我们在放疗完成后两天开始每天纵向治疗使用血脑屏障可通透的CD36抑制剂磺基琥珀酰亚胺油酸（SSO）43（图S4D）。
3. 重要的是，与单独放疗相比，SSO治疗结合放疗可显著提高携带胶质母细胞瘤的小鼠的生存率（图3K）。
4. 与RT +vehicle相比，RT +SSO中的LLM频率呈中度下降，仅MDM-TAM亚群中差异显著（图3L和S4E）。
5. 经SSO处理的肿瘤显示出MHC-II+ MDMs的群体显著增加（图S4F），而淋巴免疫组成和活化保持不变（图S4G-S4I）。
6. 这些实验建立了针对LLMs的潜在概念验证，促使我们进一步研究它们在胶质母细胞瘤TME中出现的机制基础及其促肿瘤功能。

[图片上传失败...(image-97391f-1727040176307)]

• 图S4：验证髓鞘来源脂质作为TAM表型的调节剂，其可以通过CD36抑制与放疗联合使用来改变，与图3和图4相关（A）点图显示小鼠单细胞RNA测序数据集中最丰富细胞类型的CD36 RNA表达水平。颜色代表平均表达水平；大小表示表达Cd36的细胞百分比。
• （B）在实验终点，对经过RT处理的复发性PDG-Ink4a肿瘤中各种细胞群体的CD36平均荧光强度（MFI）进行量化。肿瘤细胞：CD45−CD11b−CD31−细胞；内皮细胞：CD45−CD11b−CD31+细胞。所有巨噬细胞和LLM巨噬细胞：见图S2E。
• （C）流式细胞术量化原发、放疗后2天（5×2 Gy）以及复发性PDG-Ink4a胶质母细胞瘤中的脂质负荷（BODIPYhighSSC-Ahigh）MG（左）和MDMs（右）。
• （D）实验设计和治疗方案的示意图。按照STAR方法描述的方法启动肿瘤，以产生PDG-Ink4a肿瘤携带小鼠。在肿瘤启动后4-6周，通过MRI对肿瘤大小进行量化，并使用区组随机化方法根据肿瘤体积（20–90 mm3）均匀分配小鼠至治疗各组。治疗组为对照（DMSO）、分割放疗（RT，5×2 Gy）以及DMSO、SSO（每天30 mg/kg）或RT+SSO。
• DMSO和SSO治疗在联合治疗组中在最后一次RT剂量后48小时开始。在出现症状或指定的时点处死小鼠。
• （E）图表展示在实验终点，经过RT+DMSO和RT+SSO治疗后，从复发性PDG-Ink4a肿瘤中分离的MG（左）和MDMs（右）的脂质代谢标记物的平均荧光强度（MFI）。
• （F）流式细胞术量化MHC-II+ MDMs作为总MDMs的百分比，在实验终点经过RT+DMSO和RT+SSO治疗的复发性PDG-Ink4a肿瘤。
• （G）量化CD3+淋巴样细胞群体（作为CD45+细胞的百分比），在实验终点经过RT+DMSO或RT+SSO治疗的复发性PDG-Ink4a胶质母细胞瘤。B细胞：NK1.1−CD19+；CD8T细胞：NK1.1−CD19−CD3+CD8+；CD4T细胞：NK1.1−CD19−CD3+CD4+。
• （H和I）图表展示在实验终点经过RT+DMSO或RT+SSO治疗的复发性PDG-Ink4a胶质母细胞瘤中，CD8 T细胞（H）和CD4 T细胞（I）的所示活化标记物的平均荧光强度（MFI）。
• （J）胆固醇从头生物合成途径的示意图，描绘了胆固醇前体和衍生物以及涉及的酶（斜体）。通过脂质组学（图4A-4C）和RNA-seq（图4D）确定的LLMs中增加的酶和中间体用绿色标记，减少的用红色标记。
• （K）代表性IF图像，展示新鲜冷冻的复发性PDG-Ink4a胶质母细胞瘤组织切片中LLM相对于髓鞘碱性蛋白的位置。DAPI：核染（蓝色）；IBA1：泛巨噬细胞（洋红色）；PLIN2：脂滴（LDs）（白色）；髓鞘碱性蛋白（MBP）（黄色）。T，肿瘤；H，相邻的正常大脑。
• （L）饼图展示从健康小鼠大脑中分离的髓鞘中发现的每种主要脂质物种的平均比例。此图的数据通过NMR量化胆固醇（红色）以及通过Lipidyzer分析量化其他脂质类别（灰色）。统计方法：混合效应分析（B和C）或两因素方差分析，Sídák校正进行多重比较（E-I）。数据表示为平均值+SEM（B和G-I），±SEM（C、E和F）或±SD（L）。

Myelin debris in the TME drives cholesterol accumulation and LXR activation in TAMs

肿瘤微环境中的髓鞘碎片驱动 TAMs 中胆固醇积累和 LXR 激活

Para_01

1. 我们研究了LLMs与非LLM对照在体内特有的脂质体景观，这可能是它们促进肿瘤形成的特性的基础。脂质组学分析显示LLMs中固醇、鞘磷脂、胆固醇酯（CEs）和三酰甘油的水平升高（图4A）。值得注意的是，LLMs中胆固醇及其前体物质的水平升高，例如5α-7,24-胆固醇二烯、羊毛甾醇和脱莫瓦龙酸（图4B和4C）。有趣的是，参与胆固醇从头合成途径的多个酶的下调（图4D和S4J）表明，LLMs中观察到的胆固醇积累来源于TME中的外部来源，而不是从头合成。这些发现与神经退行性疾病中泡沫状巨噬细胞的表型相呼应，其中胆固醇丰富的髓鞘碎片吞噬作用触发胆固醇积累和胆固醇生物合成关闭。这种负反馈导致胆固醇前体物质如脱莫瓦龙酸的积累，进而激活肝X受体（LXR），通过增加胆固醇外流来克服胆固醇过载。
2. ,

[图片上传失败...(image-c5811b-1727040176307)]

• 图4：LLM的形成依赖于髓鞘吞噬作用及随后的固醇积累（A和B）所示脂质类别的标准化水平（图S6J中的缩写）以及FACS纯化的LLM和非LLM中固醇的校正面积比。（C）根据（B）中的脂质组学分析评估的FACS纯化的LLM和非LLM中的脱氢胆固醇浓度。（D）根据图3B中的FACS纯化的LLM和非LLM的胆固醇合成途径基因的标准化表达。（E）从肿瘤中分离出的髓鞘中存在的主要脂质种类的平均比例。（F）初级PDG-Ink4a肿瘤切片的代表性电子显微镜图像。框1.2和2.2分别是框1.1和2.1的高倍图像。（G）初级PDG-Ink4a肿瘤切片的代表性IF图像。DAPI：核染料（蓝色）；IBA1：泛巨噬细胞（洋红色）；PLIN2：脂滴（白色）；MBP：髓鞘碱性蛋白（黄色）。（H）初级PDG-Ink4a肿瘤中TAM亚群的平均MBP强度定量（如图S4K所示）。每个点代表单个TAM（IBA1+），大小对应细胞面积。（I）代表一个IBA1+PLIN2+LLM的视觉IF图像，以及用于注释单个TAM（IBA1+）作为MBP+（与MBP的最小距离小于0像素），靠近MBP（0-5像素）或远离MBP（>5像素）的距离到髓鞘。（J）根据（I）中描述的每个TAM的最小距离与MBP+染色的相关性，定量每个TAM中存在的脂滴总数。（K）图S5C所示的体外LLM的流式细胞术定量。（L）根据（K）中使用的FACS纯化的dTomato+BMDMs的RNA-seq确定的差异表达基因（表S5A）。（M）根据（L）得出的特征进行GSEA富集的相关途径的p值（表S5B-S5J）。统计方法：两因素方差分析，采用Sídák校正进行多重比较（A和B），双尾配对t检验（C和D），成对比较分析成对的多种群均值（H），成对比较分析成对的多种群均值（J），单因素方差分析，采用Sídák校正进行多重比较（K），结合Benjamini-Hochberg校正的Fisher精确检验（M）。数据表示为平均值+SEM（A-D和K）或±SD（E）。另见图S4和S5及表S5。

Para_01

1. 为了探讨髓鞘作为赋予TAMs LLM表型的脂质关键来源的潜力，我们首先使用髓鞘碱性蛋白（MBP）作为标志物，探查了肿瘤组织中髓鞘的存在。
2. 在TME中，与PLIN2+LLMs相邻的区域，发现了类似髓鞘碎片的结构，其构型与健康脑组织中的髓鞘相比发生了扭曲（图S4K）。
3. 重要的是，从胶质母细胞瘤肿瘤中分离出的髓鞘的脂质组学分析，证实了胆固醇的过度表达，与非肿瘤负荷大脑中的髓鞘相似（图4E和S4L）。
4. 探测脱髓鞘和再髓鞘化的转录特征45显示与胶质母细胞瘤肿瘤呈正相关，而与相邻正常脑组织无关，证实了髓鞘碎片在胶质母细胞瘤中的积累（图S5A和S5B）。
5. 这些发现暗示脱髓鞘和再髓鞘化途径在胶质母细胞瘤中被触发，可能是TME中髓鞘碎片存在的基础。
6. 重要的是，电子显微镜（EM）成像在体内确认了髓鞘碎片存在于巨噬细胞吞噬体中（图4F）。
7. 此外，髓鞘吞噬和MBP在TAMs中的积累与尺寸增加和脂质积累相连贯，表明巨噬细胞吞噬并回收髓鞘成脂质（图4G-4J）。
8. 这些发现强调了巨噬细胞需要清除髓鞘碎片，以在胶质母细胞瘤TME中获得LLM表型。

[图片上传失败...(image-a72eab-1727040176307)]

Para_01

1. 为了确认局部髓鞘碎片摄取在LLM形成中的作用，我们建立了一个离体共培养系统，其中dTomato+骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）暴露于分离的小鼠胶质母细胞瘤肿瘤中，这些肿瘤之前有或没有经过髓鞘耗竭处理（图S5C）。
2. 有趣的是，整个分离的肿瘤或仅髓鞘碎片均导致了显著的LLM形成，而在没有髓鞘的情况下，这种效应消失了（图4K和S5D），这突显了髓鞘作为脂质来源对TAMs获取富含脂质的表型的重要作用。
3. 有趣的是，与仅含髓鞘的情况相比，添加整个肿瘤（含髓鞘）使总的脂质含量增加了3倍，而仅含髓鞘的情况下增加了2倍（图S5D），这表明TME在启动巨噬细胞LLM表型中有所贡献。

Para_02

1. 为了解析来自肿瘤微环境（TME）或髓鞘本身的信号线索对LLM形成的贡献，我们对来自体外共培养实验的dTomato+ BMDMs进行了FACS分离并进行了RNA-seq（图4L和S5C；表S5A-S5L）。
2. 有趣的是，参与吞噬作用和补体激活的通路的上调提示TME赋予了"吃我"信号，指导巨噬细胞增强其吞噬能力（图S5E）。
3. 重要的是，这些信号可能调节髓鞘的特异性摄取，因为条件培养基（CM）教育的巨噬细胞中CD36的抑制阻碍了髓鞘的吞噬，但并未损害微球体的吞噬（图S5F）。
4. 正交地，髓鞘暴露诱导了参与胆固醇代谢和脂质运输的通路表达，同时下调了胆固醇生物合成（图S5E），与体内LLM特征相似（图4D）。
5. 有趣的是，TME和髓鞘来源信号指导巨噬细胞教育的交叉点包括吞噬脂质、吞噬作用和LXR通路激活的通路的上调，以及与脂质输出相关的基因（Abca1）表达的增加（图4M）。
6. 令人惊讶的是，在髓鞘存在的情况下，TME特异性的教育促进巨噬细胞的炎症反应被抑制（图4M），推断胶质母细胞瘤诱导的炎症被这种脂质源所阻碍，从而促进了LLM的免疫抑制表型（图3I）。
7. 总的来说，这些发现揭示TME来源的信号使巨噬细胞清除髓鞘碎片作为脂质源。反过来，吞噬的髓鞘碎片驱动胆固醇前体的积累，激活LXR，从而减弱炎症活动并上调LLM中的脂质输出。

MES-like glioblastoma cells enhance TAM-mediated myelin recycling and lipid export into the TIF

类似于MES的小胶质母细胞增强TAM介导的髓鞘回收和脂质向TIF的输出

Para_01

1. 我们接下来旨在探究髓鞘回收在LLM（低级别孤立性脑膜瘤）与胶质母细胞瘤细胞交互作用中的功能意义。为了在体外模拟这种相互影响，我们从原发或复发性PDG-Ink4a肿瘤中分别产生了类似OPC（少突胶质细胞前体）和MES（间充质样）的胶质母细胞瘤细胞系。
2. 原发/OPC样和复发性/MES样胶质母细胞瘤细胞表达了它们所代表亚型的特征性基因，MES样胶质母细胞瘤细胞显示糖酵解活动显著增加，代表它们在体内的特性（见图5A和S5G-S5J）。
3. 当BMDMs（骨髓来源的巨噬细胞）被胶质母细胞瘤肿瘤条件化培养基（TCM）教育后，髓鞘碎片吞噬作用增强，而非一般吞噬作用（见图S5K和S5L），导致脂质积累增加（见图5C和S6A），这与体内LLM表型相似（见图S2B和S2E）。
4. 类似地，TCM介导的原代MG（小胶质细胞）的启动增加了对髓鞘碎片反应的LLM形成（见图S6B），强调髓鞘介导的LLM表型不仅限于MDMs（单核细胞来源的巨噬细胞）。
5. 尽管OPC样和MES样胶质母细胞瘤细胞都能指导BMDMs中的LLM形成，但MES样胶质母细胞瘤细胞的高度糖酵解特征（见图5A和S5J）影响了此过程，如通过抑制糖酵解导致LLM生成减少所示（见图S6C）。
6. 此外，暴露于髓鞘（而非TCM）触发了H3K27me3的上调（见图5D），强化了髓鞘在调控基因表达变化以获得巨噬细胞LLM表型中的作用。

[图片上传失败...(image-dabe32-1727040176307)]

• 图 5. LLM 中的 LXR 信号通路激活促进 TME 内的脂质交换（A）在由原发/OPC 样（n = 4）或复发性/MES 样（n = 4）PDG-Ink4a 肿瘤生成的胶质母细胞瘤细胞系上进行 Seahorse 糖酵解活性实验，随时间变化的细胞外酸化速率（ECAR）。（B）BMDMs 中髓鞘羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）摄取（MFI）的相对倍数变化。（C）BMDMs 在髓鞘暴露下相对于对照组（无髓鞘）的 BODIPY MFI 相对倍数变化。（D）BMDMs 在单培养（±髓鞘）或与 MES 样胶质母细胞瘤细胞共培养时 H3K27me3 MFI 的相对倍数变化。（E 和 F）通过定量实时 PCR（RT-qPCR）评估 BMDMs 暴露于（E）对照培养基或 MES 样 TCM 以及（F）MES 样 TCM ± 髓鞘时的 LXR 信号通路基因的相对表达。（G）在小鼠单细胞 RNA 测序数据集（图 1B）中确定的最多细胞类型的脂质输出和脂蛋白受体基因的表达水平。（H）BMDMs 在体外与髓鞘接触 24 小时后，上清液中游离胆固醇的量化。（I）实验设计说明从胶质母细胞瘤中收集 TIF（参见 STAR 方法）。（J）TIF 中检测到的总脂质（峰值的总和）的相对水平。（K）TIF 中胆固醇酯（CE）水平与 Ntb 组织（对照）相比的倍数变化。统计方法：Friedman 测试配合 Dunn 多重比较校正（B、C、J 和 K），单因素方差分析配合 Sídák 校正（D），双因素方差分析配合 Sídák 多重比较校正（E 和 F），或双尾配对 t 检验（H）。数据表示为平均值 + SEM（A-C）或 ± SEM（D-F、H、J 和 K）。另见图 S5 和 S6。

[图片上传失败...(image-9a104e-1727040176307)]

• 图S6. 分析巨噬细胞中髓鞘诱导的LXR激活，该细胞在TME中协调脂质交换，与图5相关（A）代表来自BMDMs的流式细胞术图，BMDMs暴露于MES样TCM±髓鞘，如图S5K所示。门控设置在BODIPYhigh和SSC-Ahigh的BMDMs上，以识别LLMs in vitro。（B）流式细胞术定量LLMs（BODIPYhigh，SSC-Ahigh）作为先前暴露于对照培养基或MES样TCM的主要小胶质细胞（MG）的百分比，髓鞘碎片暴露后24小时（3小时）。（C）MES样TCM培养的BMDMs暴露于髓鞘（3小时）后的BODIPY MFI倍数变化，与未暴露于髓鞘的情况相比。MES样TCM取自用糖酵解抑制剂2-DG处理或不处理的细胞（图S5K）。通过流式细胞术使用BODIPY染色评估BMDMs对髓鞘摄取的脂质积累。（D和E）通过qPCR评估代表LLM特征的基因的表达（如图1I所示），BMDMs暴露于（D）MES样TCM±髓鞘1小时或24小时，（E）对照培养基或MES样TCM单独。（F）通过qPCR评估BMDMs在MES样TCM条件下暴露于髓鞘±LXR抑制剂时Abca1、Abcg1、Dhcr24和Nr1h3的相对表达。（G和H）对Filipin（胆固醇染色）进行了体外BMDMs的免疫荧光染色，BMDMs在MES样TCM±LXR抑制剂（LXRi）条件下培养24小时，并暴露或未暴露于髓鞘（3小时）。直方图描绘每个BMDM（G）或BMDMs中的每个脂质滴（H）的Filipin平均强度。线条代表中位数和四分位数。（I）小提琴图描绘了从小鼠单细胞RNA测序数据集中提取的胆固醇外流相关基因Abca1、Abcg1、Apoc1和Apoe在LLMs和非LLMs中的标准化基因表达水平。（J）通过脂质组学分析，在原发性/OPC样和复发性/MES样PDG-Ink4a肿瘤的TIF中定量所示的脂质类与非肿瘤大脑（Ntb）组织相比的倍数变化。BRSE，菜油酸酯；CASE，菜油酸酯；CL，心磷脂；CE，胆固醇酯；Cer_BS，神经酰胺β-羟基脂肪酸-鞘磷脂；Cer_NS，神经酰胺非羟基脂肪酸-鞘磷脂；CoQ，辅酶Q；DG，二酰甘油；FA，游离脂肪酸；LPC，溶血磷脂酰胆碱；LPI，溶血磷脂酰肌醇；MGDG，单半乳糖基二酰甘油；PA，磷脂酸；PC，磷脂酰胆碱；PE，磷脂酰乙醇胺；PE_Cer，神经酰胺磷脂酰乙醇胺；PG，磷脂酰甘油；PI，磷脂酰肌醇；PI_Cer，神经酰胺磷脂酰肌醇；PS，磷脂酰丝氨酸；SHexCer，硫苷脂；SM，鞘磷脂；SSulfate，固醇硫酸酯；TG，三酰甘油；CAR，酰基肉碱；ST，固醇。（K）Ntb小鼠、原发性/OPC样和复发性/MES样PDG-Ink4a肿瘤的间质液中神经酰胺（Cer）物种水平的相对倍数变化。（L）在Ntb、原发性、RT复发性和SSO处理的复发性PDG-Ink4a肿瘤的间质液中检测到的总脂质水平（总峰面积）。图5J中的Ntb、原发性和复发性PDG-Ink4a组的数据点。（M）在Ntb、原发性、RT复发性和SSO处理的复发性PDG-Ink4a肿瘤的肿瘤间质液（TIF）中定量胆固醇酯（CE）的相对水平。图5K中的Ntb、原发性和复发性PDG-Ink4a组的数据点。统计：双向方差分析，Sídák校正进行多重比较（B、D-F、J和K），两阶段逐步配对t检验（C），或混合效应分析，Sídák校正进行多重比较（G、H、L和M）。数据表示为平均值+SEM（B、C和F）和±SEM（D、E和J-M）。

Para_01

1. 接下来，我们进一步研究了LLM和MES样胶质母细胞之间的相互作用，这是基于我们观察到的这两种细胞类型在转录水平和空间水平上的强烈相关性（图1J和2D）。
2. 当BMDM暴露于MES样TCM+髓鞘碎片时，会诱导BMDM获取LLM特异基因，而这种诱导作用仅靠MES样TCM是无法实现的（图S6D和S6E）。
3. 尽管MES样TCM能增加编码LXR-α蛋白的Nr1h3基因表达（图5E），但在此背景下需要髓鞘的存在来上调ATP结合盒转运体Abca1和Abcg1（均为LXR激活的下游分子）的表达，并下调Dhcr24的表达（图5F），
4. 正如体内观察到的，这是细胞内胆固醇和desmosterol积累的标志，继髓鞘摄取后发生（图4B–4D和S4J）。
5. 如预期那样，由于desmosterol在泡沫状巨噬细胞形成过程中激活LXR的激动作用，LXR的药理抑制阻碍了髓鞘诱导的脂质输出基因Abca1和Abcg1的表达（图S6F），导致胆固醇在巨噬细胞中积累（图S6G和S6H）。
6. 这些胆固醇流出转运体主要在TAMs中表达（图5G），并在胶质母细胞瘤LLMs中上调（图S6I）。
7. 与这种脂质转运体表达增加一致，巨噬细胞在体外摄取髓鞘后能有效流出胆固醇（图5H）。
8. 这一发现促使我们评估原发/OPC样和复发/MES样胶质母细胞瘤的肿瘤间质液（TIF）中的脂质含量（图5I）。
9. 脂质组学分析显示，MES样、LLM富集肿瘤的TIF中检测到的总脂质量增加（图5J和S6J），包括CEs（图5K），之前发现LLMs中CEs水平升高（图4A）。
10. 由于CEs是高密度脂蛋白（HDLs）的主要成分，而HDL介导的脂质转运活性在髓鞘暴露后巨噬细胞中上调（图S5E），这些结果表明LLMs中HDL介导的胆固醇流出增加。
11. 此外，MES样富集的复发性胶质母细胞瘤显示出神经酰胺水平升高（图S6K），这是一种与脱髓鞘有关的脂质类别。
12. 总的来说，这些数据揭示了一种调节机制，其中髓鞘碎片增加的水平是MES样胶质母细胞瘤中LLM积累的基础。
13. 值得注意的是，经SSO处理的阻碍LLM形成的复发性肿瘤（图3K，3L和S4E）显示出TIF总脂质水平降低（图S6L），包括CEs（图S6M）。

Para_02

1. 总之，这些发现揭示了大脂质分子不仅含有多种脂质类别的增加水平，而且通过肿瘤微环境介导的LXR途径的激活，将髓鞘来源的脂质输出到肿瘤间质中。
2. 这些结果促使我们进一步研究大脂质分子介导的胆固醇外流对胶质母细胞瘤癌细胞的恶性特征的意义。

Myelin-induced LLMs fuel MES-like glioblastoma cell malignancy

髓磷脂诱导的LLMs促进类似MES的胶质母细胞瘤细胞恶性

Para_01

1. 为了确定胶质母细胞瘤细胞在吞噬和加工髓鞘后如何从LLM衍生的脂质中获益，我们检查了需要此类外部脂质源的不同胶质母细胞瘤亚型的代谢特征。
2. 尽管肿瘤细胞普遍显示出胆固醇从头合成途径的高转录活性（图S7A），但MES样细胞，尤其是MES2亚型，显示出最低的胆固醇生物合成活性。
3. 实际上，与其它癌细胞亚型相比，MES样细胞在多种脂质生物合成途径中表现出低活性（图6A和6B），这一特征在患者样本中也观察到（图S7B和S7C）。
4. 相反，MES2细胞表达了高水平的Vldlr（图6B），这是一种HDL的膜受体，可能有利于它们清除含有LLM衍生的胆固醇的脂蛋白（图S5E）。
5. 这使我们推测，以脂质摄取和交换为中心的代谢串扰是MES样细胞与LLM相互作用的核心。
6. 实际上，髓鞘中的脂质并不容易获得肿瘤细胞（图S7D），当暴露于髓鞘后，肿瘤细胞的增殖在巨噬细胞耗竭的ex vivo中减少了（图S7E和S7F）。
7. 重要的是，通过重新引入巨噬细胞，可以挽救髓鞘对胶质母细胞瘤癌细胞的脂毒性效应，揭示了巨噬细胞在回收髓鞘碎片以保护并使肿瘤细胞受益中的重要性（图S7F）。
8. 通过追踪共培养中加载了可点击胆固醇的BMDM中的脂质命运（图S7G），我们发现直接转移发生在MES样而不是OPC样胶质母细胞瘤细胞中（图6C）。
9. 为了探究肿瘤细胞是否清除LLM介导的髓鞘回收产生的脂质，我们设计了一个多组学共培养实验，在不同条件的髓鞘暴露下，随后对FACS纯化的胶质母细胞瘤癌细胞进行定量脂质组学和转录组学分析（图S7H）。
10. 在单培养中，暴露于髓鞘的MES样细胞并未显示脂质含量改变（图6D），这与它们无法吞噬髓鞘碎片的能力相符（图S7D）。
11. 然而，在这种条件下，与细胞应激相关的过程被上调，而与增殖相关的途径被降低（图S7I和S7J），强调了髓鞘对肿瘤细胞的脂毒性特征（图S7F；表S6A和S6B）。
12. 特别地，当与巨噬细胞共培养并在髓鞘存在下，多种脂质类别逐渐在MES样肿瘤细胞中积累，包括胆固醇和甘油三酯（TGs）（图6D和6E）。
13. 在转录上，MES样肿瘤细胞上调了多种参与增殖和细胞周期的途径（图S8A和S8B；表S6C-S6F）。
14. 总的来说，这些分析揭示了TAM/癌细胞相互作用的分子机制，通过这些机制，LLM处理的髓鞘衍生的脂质促进肿瘤生长。

[图片上传失败...(image-16c244-1727040176307)]

• 图S7：在鼠肿瘤中保存的人间充质胶质母细胞瘤代谢特性，这是MES样肿瘤细胞外包脂质需求的底层，与图6相关（A）点图显示在鼠单细胞RNA测序数据集中识别的最丰富细胞类型中从头合成胆固醇生物合成基因的表达水平（图1B）。颜色代表平均表达；大小表示表达每个特定基因的细胞百分比。（B）点图显示在患者单细胞RNA测序数据集中识别的胶质母细胞瘤细胞亚型中从头合成胆固醇生物合成和导入基因的表达水平。点颜色代表平均表达；大小表示表达每个特定基因的细胞百分比。（C）雷达图描绘了从患者单细胞RNA测序数据集中提取的OPC、MES、NPC和AC胶质母细胞瘤癌细胞之间表示的代谢途径（KEGG）的标准化GSEA评分（基于每个途径在0到1之间）。灰色区域代表所有肿瘤细胞中每个代谢途径的平均活性。（D）图表显示BMDMs或OPC样和MES样胶质母细胞瘤细胞中CFSE标记的髓鞘摄取的MFI。（E）ex vivo实验的示意图，用于EdU和Annexin V染色，如图F及图6K和S8G-S8I所示。从PDG-Ink4a胶质母细胞瘤荷瘤小鼠中提取原发肿瘤，并在磁珠介导的髓鞘去除和/或CD11b+细胞耗竭之前分离成单细胞。然后将分离的肿瘤放置在培养中24小时，更换培养基以去除细胞碎片，并在指定时加入LXRi、ABCA1i或BMDMs。肿瘤细胞增殖（EdU染色）或活力（Annexin V-，Zombie-）在48小时后通过流式细胞术评估。（F）直方图显示与无CD11b+ Abca1/Abcg1KO BMDMs±髓鞘的肿瘤细胞相比，S期（EdU+）肿瘤细胞的倍数变化。培养条件在（E）中描述。（G）体外LLM/胶质母细胞瘤细胞共培养实验设计的示意图：如前所述（图S5K），在OPC样或MES样TCM中培养的BMDMs过夜暴露于（1）可点击的胆固醇或（2）髓鞘3小时，并与胶质母细胞瘤细胞共培养。（1）通过流式细胞术测量BMDMs向胶质母细胞瘤细胞转移胆固醇的摄取/转移，在共培养0、1和3小时后进行Click-iT反应（见STAR Methods）。（2）共培养48小时后（EdU染色）通过流式细胞术测量胶质母细胞瘤细胞增殖。（H）体外LLM/MES样胶质母细胞瘤癌细胞共培养设计示意图，研究巨噬细胞介导的髓鞘回收对肿瘤细胞脂质体和转录组的影响：在添加BMDMs（或不添加）进行共培养之前，MES样肿瘤细胞在2%无脂质FBS DMEM中生长。24小时后，根据需要在MES样肿瘤细胞和BMDMs FACS分离之前添加髓鞘不同的持续时间（0、6或24小时），然后进行下游批量RNA测序或脂质组学分析（见STAR Methods）。（I）火山图显示MES样肿瘤细胞在髓鞘碎片中培养24小时或未培养的差异性表达基因。颜色对应于显著增加（红色）或减少（蓝色）的基因。通过如图H所示的FACS纯化的MES样肿瘤细胞的批量RNA测序识别基因。（J）条形图显示MES样肿瘤细胞在单培养中对髓鞘暴露做出反应时，与基因下调（蓝色）或上调（红色）相关的相关途径的调整p值。统计方法：单向ANOVA（D）或双向ANOVA与Sídák校正进行多次比较（F）或Fisher精确检验结合Benjamini-Hochberg方法进行多假设检验校正（J）。数据表示为平均值±SEM（D和F）

[图片上传失败...(image-eadd3b-1727040176307)]

• 图6. LLM介导的脂质输出为脂质匮乏的胶质母细胞瘤TME中的MES样细胞恶行提供燃料（A）来自小鼠单细胞RNA测序数据集的胶质母细胞瘤细胞亚型中的归一化GSEA评分。灰色区域=每个通路的平均代谢活动。（B）来自小鼠单细胞RNA测序数据集的胶质母细胞瘤细胞亚型中的胆固醇生物合成和导入基因的表达水平。（C）胆固醇含量在胶质母细胞瘤细胞与预先加载了可点击胆固醇的BMDMs共培养后的流式细胞术MFI量化。（D）在MES样肿瘤细胞与TAMs+髓鞘共培养或单培养中，与无髓鞘比较，描绘的脂质类别的倍数表达变化（x轴）和-log10 p值（y轴）。（E）MES样胶质母细胞瘤细胞在单培养或与BMDMs共培养暴露于髓鞘时的胆固醇和甘油三酯（TG）水平。（F）在MES样胶质母细胞瘤细胞中，基于脂质ng/μg蛋白的标记13C在各可量化脂质类别中的相对分布，在给予CE13C-FA后24小时。（G）在检测到U13C-FA18:1的脂质种类中，每种脂质种类代谢的CE13C-FA的量化。（H）在与TCM处理的BMDMs±髓鞘共培养48小时后，胶质母细胞瘤细胞在S期（EdU+）的百分比。（I）电子显微镜代表图像，描绘MES样肿瘤细胞（T）与载有髓鞘的BMDMs（M）之间的接触点。LD，脂滴；CV，涂层囊泡；MD，髓鞘碎片。（J）在与TCM处理的BMDMs±髓鞘，±CD36抑制剂（SSO）±ABCA1抑制剂valspodar（ABCA1i）共培养48小时后，MES样胶质母细胞瘤细胞在S期（EdU+）的百分比。（K）在分离的胶质母细胞瘤中，维持（+CD11b+）或体外耗竭（-CD11b+）（图S7E）±ABCA1i或LXR抑制剂GSK2033（LXRi）的情况下，活胶质母细胞瘤细胞（ZombieNIR-，Annexin V-）占总肿瘤细胞的百分比。统计：双向方差分析（C，E，H和K）和带Sídák校正的混合效应分析进行多重比较（J）。数据表示为平均值+SEM（C，E，G，H，J和K）。另见图S7和S8及表S6。

[图片上传失败...(image-81606c-1727040176307)]

• 图S8。关于巨噬细胞介导的髓鞘回收在保护肿瘤细胞免受脂毒性侵害以及以LXR-Abca1/Abcg1依赖方式为MES样细胞供能的扩展分析，与图6相关（A）维恩图描绘了在与BMDMs共培养的MES样肿瘤细胞中，在无（对照）或存在髓鞘碎片（+髓鞘碎片）的情况下，与单培养的MES样肿瘤细胞相比差异表达的基因（表S6）。基因通过图S7H所述的FACS纯化的MES样肿瘤细胞的批量RNA-seq确定。（B）条形图描绘了MES样肿瘤细胞与BMDMs（±髓鞘碎片）共培养时，与单培养的MES样肿瘤细胞相比下调（左）和上调（右）的通路p值（图S7H）。（C）代表性IF图像，显示了MES样肿瘤细胞在不同时间点（添加Click-CE后的0、8和24小时）暴露于含有胆固醇（左，黄色）或脂肪酸（右，粉红色）的胆固醇酯（CEs）。（D）代表性流式细胞术绘图，描述了EdU增殖分析的门控策略，其中EdU+细胞表示S期的细胞，如图（E）、（F）和图6H、6J所示。（E）图表描绘了与预先暴露于髓鞘（3小时）或未暴露的TCM预处理的BMDMs共培养48小时后，处于S期（EdU+）的活胶质母细胞瘤细胞的百分比。（F）图表描绘了与野生型或Abca1/Abcg1 KO BMDMs共培养48小时后，在MES样TCM±髓鞘（3小时）预先培养的MES样胶质母细胞瘤细胞中S期（EdU+）细胞的百分比。（G）在体外实验中，将活胶质母细胞瘤细胞（ZombieNIR−，Annexin V−）占总肿瘤细胞（CD45−CD11b−细胞）的百分比进行量化（图S7E）。从携带肿瘤的小鼠中分离出PDG-Ink4a胶质母细胞瘤，并将其解离成单细胞，在补充了富含脂质的FBS的培养基中培养。从解离的肿瘤中保持（+CD11b+）或耗尽（−CD11b+）髓样细胞，并加入ABCA1抑制剂valspodar（ABCA1i）或LXR抑制剂GSK2033（LXRi）。（H和I）在体外实验中，将活胶质母细胞瘤细胞（ZombieNIR−，Annexin V−）占总肿瘤细胞（CD45−CD11b−细胞）的百分比进行量化（图S7E）。从携带肿瘤的小鼠中分离出PDG-Ink4a胶质母细胞瘤，并将其解离成单细胞，在补充了无脂质FBS的培养基中培养。在将野生型或Abca1/Abcg1 KO BMDMs（预先暴露于髓鞘碎片或未暴露）添加到解离的肿瘤中之前，耗尽髓样细胞（−CD11b+）±LXR抑制剂GSK2033（LXRi）。(I)中的未处理（无处理）对照组数据取自（H）。统计方法：Fisher精确检验与Benjamini-Hochberg方法结合用于多重假设检验校正（B），两因素ANOVA与Sídák校正用于多重比较（E和G-I），或混合效应分析配合Tukey校正用于多重比较（F）。数据表示为平均值+SEM（E-I）

Para_01

1. 巨噬细胞主要运输胆固醇的酯化形式，这促使我们追踪胆固醇/胆固醇酯在类似间充质肿瘤细胞内的整合，使用带有可点击手柄的胆固醇酯，这种手柄要么位于胆固醇组分上，要么位于脂肪酸链上。值得注意的是，胆固醇早期就定位在类似脂质滴的结构中，除了在24小时后明显整合到膜状结构中外（图S8C）。与之不同的是，脂肪酸最初弥漫分布，这表明它们整合进入了细胞质，而随着时间的推移，脂肪酸在脂质滴中积累（图S8C）。另外，我们使用均匀标记的油酸（U13C-FA18:1）作为胆固醇油酸酯（CE13C-FA）中脂肪酸组的碳追踪剂，结果表明U13C-FA18:1在类似间充质癌细胞中整合后大部分未发生代谢，既没有延长也没有缩短（图6F）。油酰基卡尼汀（CAR 18:1）的微标记，这是将U13C-FA18:1导向线粒体代谢所必需的中间体，以及三羧酸循环中间体柠檬酸、苹果酸和天冬氨酸的未检测标记，表明CE衍生的脂肪酸并未整合进入三羧酸循环进行脂肪酸氧化或能量生产（图6F）。相反，代谢的CE13C-FA衍生的脂肪酸被整合进入磷脂（主要是磷脂酰胆碱[PCs]）（图6G），这表明它们作为细胞膜构建块的角色，与基于点击化学的免疫荧光染色结果一致（图S8C）。总的来说，这些结果表明，通过代谢髓鞘，LLMs不仅保护癌细胞免受脂毒性，而且还积极为它们提供髓鞘衍生的甾醇和脂肪酸，这些物质要么被储存，要么作为细胞膜生物合成的构建块被使用。

Para_02

1. 我们接下来研究了LLM将髓鞘来源的脂质直接转移给胶质母细胞瘤MES样细胞的功能后果。
2. 在共培养中，负载髓鞘的BMDMs以细胞-细胞接触依赖的方式增强了MES样细胞的增殖（图6H和S8D）。
3. 细胞-细胞接触的需求进一步得到了电子显微镜成像的支持，揭示了BMDMs与MES样胶质母细胞瘤细胞之间的紧密相互作用，以及两种细胞类型之间包被囊泡的释放/摄取（图6I）。
4. 这些结果表明，肿瘤细胞对LLM来源的髓鞘脂质的摄取既涉及被动机制也涉及主动机制。
5. 实际上，通过药物抑制脂肪受体CD36或脂肪出口蛋白ABCA1，两者在LLM中上调（图3I和S6I）并受LXR途径调控，取消了LLM赋予MES样胶质母细胞瘤细胞的促增殖效应（图6J）。
6. 这些结果使用从LysM-Cre Abca1/Abcg1fl/fl小鼠中分离的BMDMs进行了遗传验证（图S8F）。

Para_03

1. 有趣的是，抑制ABCA1或LXR可以显著降低ex vivo肿瘤细胞活力，尤其是在脂质自由培养基共培养的条件下，这种条件下肿瘤细胞在摄取髓鞘后依赖LLM供应的脂质（图6K和S8G）。
2. 这些结果显示，LXR和ABCA1阻断对肿瘤细胞生长的抑制依赖于LLM和肿瘤细胞之间的脂质交换，因为这些抑制剂并未阻碍脂质丰富培养基或缺乏巨噬细胞时胶质母细胞瘤细胞的活力。
3. 这一机制在使用LysM-Cre Abca1/Abcg1fl/fl巨噬细胞的ex vivo共培养中进一步得到验证，证实了LLM对MES样癌细胞增殖促进作用依赖于Abca1/Abcg1和LXR（图S8H和S8I）。
4. 总的来说，这些发现揭示了LLM和MES样肿瘤细胞之间的共生关系，其中胶质母细胞瘤细胞通过促进其脂质摄取能力来指导LLM的形成。
5. 反过来，负载髓鞘的LLM通过ABCA1介导的胆固醇/胆固醇酯流出和脂质转移来促进MES样胶质母细胞瘤细胞的增殖。
6. 因此，阻止LLM向胶质母细胞瘤细胞转移脂质可以抑制LLM的促肿瘤生成作用。

LLMs predict glioblastoma survival and response to immunotherapy

LLMs 预测胶质母细胞瘤生存期和对免疫治疗的反应

Para_01

1. 为了评估我们发现的转化潜力，我们使用癌症基因组图谱（TCGA）和胶质瘤纵向分析（GLASS）联盟数据集，研究了LLM标志物的预后价值（图1I）。
2. 我们将原发胶质母细胞瘤样本分为LLMlow和LLMhigh组，并确定LLMhigh患者的预后明显更差（图7A）。
3. 如预期的那样，包含在LLMhigh标志物组中的大多数胶质母细胞瘤样本被归类为MES富集（图7B-7E）。
4. 然而，当从这些分析中排除MES肿瘤时，胶质母细胞瘤患者的LLMhigh分类仍与生存期缩短相关（图7F）。
5. 总的来说，这些数据强调了LLM作为诊断和分类工具的潜力，最终可能适用于将胶质母细胞瘤患者分层为个性化治疗方法的策略。

[图片上传失败...(image-fa0b7f-1727040176306)]

• 图 7.富含脂质的巨噬细胞预测患者的临床结果( A )根据原发性异柠檬酸脱氢酶野生型( IDHWT )胶质母细胞瘤患者中低、高 LLM 标志物富集将胶质母细胞瘤患者 54 , 55 分层 的 Kaplan-Meier 曲线。 ( B 和 C )盒须图描绘了所有 IDHWT 胶质母细胞瘤样本的单样本 (ss) GSEA 评分，根据它们的主导转录亚型 (CL，经典型； MES，间充质型； PN，前神经型) 在 ( B ) TCGA 54 和 ( C ) GLASS 数据集中进行分类。 55 ( D 和 E )基于 ssGSEA 评分将原发性 IDHWT 胶质母细胞瘤肿瘤分为低 / 高 LLM 富集评分的热图。 ( F )在排除间充质胶质母细胞瘤的情况下，根据低、高 LLM 标志物富集对原发性 IDHWT 胶质母细胞瘤患者进行分层的 Kaplan-Meier 曲线。 ( G )左图：泛癌症 TAM 分析的示意图。 5,19,56 右图：小提琴图显示了 TAMs 中 LLM 标志物评分的平均值。 ( H )未经治疗、复发性以及新辅助抗 PD-1 治疗的胶质母细胞瘤患者样本的单细胞 RNA-seq 数据集中 LLMs 的百分比。 57 ( I )在接受 ICB 治疗之前，响应者和非响应者黑色素瘤患者中非 LLM 或 LLM TAMs 的百分比。 58 ( J )受试者工作特征曲线，比较肿瘤突变负荷、LLMs、非 LLMs 和总巨噬细胞占 CD45 +细胞的百分比预测黑色素瘤 ICB 反应的价值。 统计分析： log-rank 检验 (A 和 F) ，Kruskal-Wallis 检验和成对比较的 Wilcoxon 检验 (B 和 C) ，单因素方差分析加 Sídák 多重比较校正 (H) ，双尾配对 t 检验 (I) 或不成对双尾引导检验 (J) 。 数据表示为平均值± SEM (H 和 I) 。

Para_01

1. 为了将LLMs的流行情况置于更广泛的视角并评估这些细胞在不同癌症类型范围内的意义，我们对pan-cancer骨髓细胞scRNA-seq中的LLM转录基因签名表达进行了查询。
2. 值得注意的是，富含LLM签名的TAMs在胶质母细胞瘤、肺癌和卵巢癌患者之间的比例差异很大，而黑色素瘤患者总体上LLMs水平较低，尽管其中一部分表现出较高的LLM富集（图7G）。
3. 鉴于LLMs的免疫抑制特征（图3I和S1J），我们评估了LLM签名是否可以预测癌症患者针对T细胞的免疫检查点阻断（ICB）反应。
4. 在最近的一项临床试验中，新辅助性抗PD-1（程序性细胞死亡蛋白1）被纳入可切除的复发性胶质母细胞瘤治疗中，并与辅助治疗相比，显示出显著的生存益处。
5. 我们查询了接受此类治疗的患者scRNA-seq数据集，结果显示，新辅助性抗PD-1治疗的胶质母细胞瘤与未经治疗的或复发性胶质母细胞瘤相比，TAM-LLMs的比例显著降低（图7H）。
6. 因此，我们假设胶质母细胞瘤患者中发现的LLMhigh转录签名可能是其对抗ICB反应差的原因，这一假设仍有待验证，因为尚无针对胶质母细胞瘤患者的已建立的ICB应答者和非应答者数据集。
7. 因此，我们查询了公开可用的黑色素瘤患者免疫治疗数据集，以评估LLM富集是否可以预测对ICB反应良好的患者群体的治疗效果。
8. 令人惊讶的是，LLMs的含量预测了黑色素瘤的治疗反应，而总的TAM水平则没有（图7I）。
9. 此外，使用LLMs作为ICB反应的生物标志物比总TAM含量或常用的肿瘤突变负担（TMB）具有更高的预测价值（图7J）。
10. 总的来说，这些发现支持LLMs作为一种预测胶质母细胞瘤患者生存和免疫治疗反应的细胞类型的相关性。

Discussion

Para_01

1. 组织驻留型和浸润型巨噬细胞的多方面表型是由多种因素塑造的，包括它们所处的肿瘤微环境（TME）中的代谢景观。
2. 在本研究中，我们不仅描述了胶质母细胞瘤TME的多组学特征，还揭示了肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）与癌细胞之间的复杂代谢交互，这种交互依赖于对富含胆固醇的髓鞘碎片进行再循环。
3. 胶质母细胞瘤细胞利用神经元的稳态功能为自己谋利，例如通过神经元拟态。
4. 同样，我们提出，胶质母细胞瘤细胞劫持并加剧了巨噬细胞在发育和稳态过程中协调脱髓鞘和再髓鞘的能力。
5. 这是通过共谋促进吞噬髓鞘碎片的细胞通路来实现的，导致TAMs因长期暴露于髓鞘碎片而出现脂质过载。
6. 这种代谢相互作用有利于类MES胶质母细胞瘤细胞，TAMs摄取、回收和处理髓鞘产生自由可用脂质的能力为它们的存活和增殖提供了燃料。
7. 值得注意的是，这种脂质在骨髓细胞和癌细胞之间的交换已在前列腺癌和肺癌中观察到。

Para_02

1. 鉴于循环胆固醇不能穿越血脑屏障，并且大脑环境在代谢上是自主的，我们的数据显示类似MES的胶质母细胞瘤细胞高度依赖局部胆固醇代谢，因此需要利用寄居细胞的稳态功能来发展成恶性肿瘤。
2. 这种代谢交互在缺氧区域尤其丰富，那里是偏好利用外源性脂质、而不是从头合成脂质的类似MES的脂质营养缺陷型胶质母细胞瘤细胞优先归巢的地方。
3. 复杂的胶质母细胞瘤微环境是治疗抵抗的基石，最终形成一个在复发性肿瘤中，尤其是MES肿瘤，动态适应的肿瘤微环境。
4. 我们在这种背景下发现的LLMs富集提出了一个疑问，即它们是否是这种转变的主要驱动因素，指挥支持胶质母细胞瘤治疗后复发的适应性机制。

Para_03

1. LLMs表现出免疫抑制特征，并与对ICB的反应呈负相关，支持LLMs积极参与胶质母细胞瘤免疫抑制微环境的观点。
2. 这些发现与先前在多发性硬化症中的研究一致，显示巨噬细胞中的髓鞘吞噬作用直接抑制T细胞增殖和神经炎症。
3. 然而令人惊讶的是，对LLMs进行体内靶向后，并未在晚期肿瘤中引起淋巴细胞的频率发生明显变化。
4. 考虑到脂质在免疫激活中的作用存在争议，仔细研究TAM介导的髓鞘回收对淋巴细胞功能的（间接）作用将是设计增强抗肿瘤反应的联合治疗策略的关键。

Para_04

1. 总之，我们对胶质母细胞瘤中一种促肿瘤发生的LLM亚群进行了深入的 功能分析，包括从研究它们的转录教育到染色质改变，再到它们的重新配置的脂质体。
2. 我们发现，脂质负载TAMs的促肿瘤功能主要是由过量 的、TME指导的髓鞘碎片摄取所驱动的。
3. LLMs在促进胶质母细胞瘤恶性中的作用发现，需要对 TAM亚群中获得特定促肿瘤功能的代谢共进化过程进行更有效的策略研究。

Limitations of the study

研究的局限性

Para_05

1. 本研究确定了巨噬细胞介导的髓鞘回收是胶质母细胞瘤中其促肿瘤表型的机制之一，主要关注胆固醇和脂肪酸在这一过程中的作用。
2. 然而，髓鞘由一系列脂质和蛋白质组成，这些成分也可能影响巨噬细胞的表型和功能。
3. 进一步实验聚焦于髓鞘回收和转移的确切机制，对于定义脂质负荷表型的其他重要调节因子将是非常重要的。
4. 另外，在体外或离体模拟巨噬细胞与类似MES的肿瘤细胞之间的代谢交叉对话，可能无法完全捕捉到肿瘤微环境的复杂性，其中多个变量，如氧气和营养的可利用性，极大地影响细胞间的相互作用。

STAR★Methods

Key resources table

关键资源表

Resource availability

资源可用性

Lead contact

主要联系人

Para_01

1. 进一步的信息和资源及试剂的请求应直接联系负责人Leila Akkari（[email protected]），并由其负责满足需求。

Materials availability

材料可用性

Para_01

1. 本研究中使用的材料和试剂列于关键资源表中。
2. 本研究中或之前研究中我们实验室生成的试剂可应要求提供。
3. 扩展的图例说明已在https://github.com/djkloosterman/Kloosterman_et_al_Cell_2024上提供。

Data and code availability

数据和代码的可获得性

Para_01

• 本研究中生成的数据使用小鼠参考基因组mm10进行了比对，并存储在GSE266149中。本研究中使用的胶质母细胞瘤生态位和亚型元模块基因列表可从Ivy胶质母细胞瘤图谱项目（GAP）或Neftel等人获取（表S2）。胶质母细胞瘤患者的单细胞RNA测序数据集由麦吉尔大学的Kevin Petrecca博士友情提供。本研究中使用的公开可用的单细胞RNA测序数据集，包括髓系细胞图谱、黑色素瘤治疗相关数据集以及胶质母细胞瘤患者对新辅助aPD157的反应，可分别从GEO获取：GSE154763、GSE120575和GSE154795。TCGA胶质母细胞瘤数据从http://gdac.broadinstitute.org/获取，使用UCSCXenaTools包。原始计数使用EdgeR进行处理。GLASS数据集从https://www.synapse.org/#!Synapse:syn17038081/wiki/585622下载，其中选择了胶质母细胞瘤和IDH野生型患者。

• 原始的小鼠单细胞RNA测序和Visium空间转录组分析代码可访问https://github.com/djkloosterman/Kloosterman_et_al_Cell_2024获取。

• 本文报告数据的重新分析所需的任何额外信息，可应要求向主要联系人索取。